水牛cd14基因shrna片段的筛选及其对相关基因表达的影响研究

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1、广西大学硕士学位论文水牛CD14基因shRNA片段的筛选及其对相关基因表达的影响研究姓名：李美青申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：石德顺；李湘萍20120628水牛CDl4基因shRNA片段的筛选及其对相关基因表达的影响研究摘要本研究主要通过筛选对水牛CDl4基因有抑制作用的shRNA片段，利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术，体外研究其对水牛外周血单核巨噬细胞CDl4基因的抑制效果及在LPS刺激下对相关基因表达的影响，以便为迸一步研究CDl4基因在布菌所致炎症反应中的作用，寻求家畜布病防治新方法奠定基础。1．设计5条水牛CDl4shRNA

2、(319／421／755／970／1041)及1条阴性对照序列(NC．1864)，构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP．shRNA。利用脂质体法将其分别与融合表达载体pDsRed．N1．buffaloCDl4共转染HEK293细胞，72h后进行QRT-PCR和FACS检测，筛选具有抑制效果的shRNA片段。结果显示：与对照组相比，各干扰组中外源水牛CDl4基因在mRNA和蛋白水平上的表达均有不同程度的降低，其中CDl4shRNA．1041靶点的抑制效率最高(氏0．01)。2．采用磷酸钙沉淀法将筛选出来的有效CDl4shRNA及无关序一‘列NC．1864的

3、慢病毒重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装和滴度测定；以慢病毒颗粒感染体外分离培养的水牛外周血单核巨噬细胞，7d后采用lug／mLLPS刺激细胞3h，QRT-PCR检测各组细胞中CDl4、TLR4、IL．6和TNF．Q基因在mRNA水平上的表达。结果显示：具有最高抑制效果的CDl4shRNA．1041有效降低了内源性CDl4基因的表达；与对照组相比，LPS刺激后，感染慢病毒的细胞CDl4mRNA表达明显受到抑制，TLR4、IL．6和TNF．Q基因InRNA表达水平也显著降低。上述结果表明，筛选获得的水牛CDl4基因319、421、755

4、、970和1041五个shRNA序列位点均能有效抑制CDl4基因的表达，其中1041位点的干扰效率最高；CDl4shRNA．1041慢病毒颗粒不仅可以成功抑制水牛外周血单核巨噬细胞CDl4mRNA的表达，还可以有效抑制LPS刺激下CDl4、TLR4、IL．6和TNF．a基因的表达，降低TLR4对LPS的信号传导效能。关键词：布氏杆菌病水牛CDl4RNA干扰慢病毒载体LPS外周血单核巨噬细胞SCREENINGOFshRNASEQUENCESRELATEDTOBUFFALoCD14GENEANDTHEIREFFECTSONTHEEXPRESSIONOFRELA

5、TEDGENESABSTRACTThepurposeofthisstudywastoscreenshRNAsequencesrelatedtobuffaloCDl4gene，andexaminetheireffectsontheexpressionofCDl4geneinbuffaloperipheralbloodmonocye／macrophageandrelatedgenesafterstimulatingbyLPS，soastoestablishafoundationforfurtherstudyingtheroleofCDl4geneinthein

6、flammatoryreactioninducedbyBrucellaandfindanewwaytopreventbrucellosisforlivestock．1．FiveCDl4shRNA(319／421／755／970／1041)sequencesandanegativecontrolsequence(NC一1864)weredesigned，synthesizedandusedtoconstructlentiviralrecombinantplasmidspSicoR-GFP．shRNA．Lentiviralrecombinantplasmids

7、pSicoR-GFP．shRNAandfusiemexpressionvectorpDsRed-N1一buffaloCDl4wereCO．transfect．edintoHEK293usingliposome．At72haftertransfection，theinterferenceeffectsofeachshRNAsequenceweredetectedbyQRT-PCRandFACSmethods．TheresultsshowedthattheexpressionofexogenousbuffaloCDl4mRNAwasreducedatdiffe

8、rentlevelforallshRNAplasmids．Amon