水牛suv39h1基因shrna片段的筛选及对外源转基因表达效率的影响

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1、分类号S82坠UDC硕士学位论文密级垒珏水牛SUV39H1基因shRNA片段的筛选及对外源转基因表达效率的影响林浪论文答辩日期2Q!三生鱼旦3目学位授予日期答辩委员会主席庄壶基数援广西大学学位论文原创性和使用授权声明IYIIIIill21111411111110111711131111115111111411111Y2407354本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究

2、工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。／坼{保密。(请在以上相应方框内打“√’’)日期：汐睦莎．防日期训lj．{，t【矿电子邮箱：qinglan91229@163．tom74仗暂m乡日H7乡胡丌林劾麟名名话签电者师系作教联文

3、导者论指作水牛SUV39H1基因shRNA片段的筛选及其对外源转基因表达效率的影响摘要转基因动物制备过程中，外源基因的表达水平受到很多因素的影响，其中表观遗传修饰是影响外源基因表达效率的一个重要因素。表观遗传修饰中，由花斑抑制因子同源物(suppressorofvariegation3-9homologlSUV39H1)基因所催化的组蛋白H3第9位赖氨酸残基位点的二甲基化和三甲基化(H3K9me2／3)作用尤为突出。本研究对抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA干扰序列进行了筛选，通过抑制稳定表达干扰素a．2b(interferon0【一2bIFNa一2b)的Bcap一37细

4、胞系中内源SUV39H1基因的表达，探讨其对外源转IFNQ·2b基因表达效率的影响及其作用机理，为寻找提高转基因动物中外源基因的表达效率提供新的思路和方法。一、SUV39H1表达载体构建及其shRNA片段的筛选1．克隆水牛SUV39H1基因3’UTR和ORF全长序列，预测水牛SUV39H1基因的miRNA序列，构建表达水牛SUV39H1基因的融合表达载体，并在细胞水平上进行检测。结果发现，与黄牛相比，水牛SUV39H1基因的ORF和3’UTR序列与其同源性分别为99％和95％；ORF序列比3’UTR序列在不同物种间表现出更强的保守性；SUV39H1基因融合表达重组质粒可以在293

5、T细胞中表达。2．利用组织切片和免疫组化技术，检测了不同发育阶段水牛卵泡SUV39H1基因的表达规律。结果发现，SUV39H1基因在各级卵泡卵母细胞的表达趋势是随着卵泡的发育成熟而逐渐降低。水牛各发育阶段卵泡的I颗粒细胞中，SUV39H1基因表达水平较高，随着卵泡的发育成熟，SUV39H1基因在颗粒细胞中的表达呈逐渐增强趋势；在卵母细胞中，只有原始卵泡中的卵母细胞细胞质和细胞核SUV39H1基因表达呈较强阳性，在初级和次级卵母细胞的细胞质和细胞核中，SUV39H1呈较弱阳性表达，在卵丘．卵母细胞复合体细胞质中呈弱阳性表达，细胞核中呈阴性表达。各级卵泡的卵泡膜中，均未发现SUV39

6、H1基因的表达。3．针对水牛SUV39H1基因CDS序列，设计了2条shRNA片段，并构建了其慢病毒表达载体pSicoR-GFP．shSUV39H1／2和阴性对照质粒pSicoR-GFP．1864。酶切和测序鉴定正确后，将shRNA表达载体质粒和水牛SUV39H1表达载体质粒按照质量比3：1的比例进行293T细胞共转染，通过qRT-PCR和Western-blot方法检测shRNAs的抑制效率。qRT-PCR结果表明，SUV39H1基因表达在阴性对照组和空白组中的表达差异不显著(尸>n仿)；相对于阴性对照组，实验组中的shRNAl和shRNA2片段对SUV39H1基因的干扰效果差

7、异显著俨<0．05)，干扰效率分别达到33．85％和78．75％。Westem-blot分析发现，SUV39H1蛋白在阴性对照组和空白组中条带清晰明显，两个干扰实验组中SUV39H1蛋白表达量均降低，与qRT-PCR结果相符合。二、SUV39H1基因shRNAs对转IFNa一2b基因细胞相关基因表达的影响。采用磷酸钙转染方法包装SUV39H1基因shRNAl和shRNA2高滴度慢病毒。利用病毒感染稳定表达IFN0【．2b基因的Bcap．37细胞系，72h后收集细胞样品，采用qRT