水牛trem1和lbp基因shrna干扰序列的筛选

《水牛trem1和lbp基因shrna干扰序列的筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、广西大学硕士学位论文水牛TREM1和LBP基因shRNA干扰序列的筛选姓名：路新梅申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：石德顺；李湘萍20120628水牛TREMl和LBP基因shRNA干扰序列的筛选摘要在细菌脂多糖(LPS)诱导的免疫反应中，髓样触发受体1(TREMl)的抑制将影响LPS的亲和性受体CDl4基因的表达；脂多糖结合蛋白(LBP)的抑制将阻断LPS与CDl4的结合路径。为了阐明布氏杆菌病发生相关基因信号转导机制，同时为利用RNA干扰技术培育抗布氏杆菌病转基因动物打下基础，本研究对抑制水牛TREMl基因和LBP基因表达的shRNA

2、干扰序列进行了筛选。一、TREMl基因shRNA筛选与病毒感染水牛单核细胞的初步研究1．克隆水牛和黄牛TREMl基因mRNAORF全长序列，构建水牛TREMl基因融合蛋白表达载体，并转染293细胞，通过ImPCR方法检测水牛TREMl基因在293细胞中的表达。结果发现，克隆得到的水牛和黄牛的TREMl基因ORF序列，两者同源性为97．2％，重组质粒pDsRed．N1．TREMl可在293细胞中表达。水牛TREMl基因序列成功提交到GenBank(JQ390222)。2．针对水牛TREMl基因CDS序列，设计5个shRNA片段并构建其慢病毒表达载体pSico

3、R．GFP．shTREM96／194／294／578／643，同时以无关序列pSicoR．1864(N．C)作为阴性对照。PCR和测序鉴定后，将水牛TREMl表达载体(靶质粒)与其shRNA表达载体(干扰质粒)分别以I：1和1：3的比例经LipofectamineTM2000脂质体共转染293细胞，通过流式细胞仪和QRT-PCR方法检测shRNA抑制效率。结果发现，靶质粒与干扰质粒转染剂量比为1：1时，shTREM．194、shTREM．294和shTREM578抑制效率分别53．86％、49．27％和40．10％；1：3比例共转染时，抑制效率分别为63．

4、07％、79．24％和31．14％。3．从水牛外周血中分离单核巨噬细胞，用TREMlshRNA慢病毒感染水牛单核巨噬细胞，通过QRT-PCR检测TREMl和CDl4基因的表达。结果表明，分离纯化水牛单核巨噬细胞，可在体外培养1周；TREMl和CDl4基因在巨噬细胞中均有表达，CDl4基因的表达量高于TREMl的表达。在未经任何刺激情况下，shRNA病毒颗粒感染单核巨噬细胞的效率不高。二、LBP基因shRNA片段筛选1．克隆水牛和黄牛LBP基因，构建其融合蛋白表达载体pDsRed．N1一LBP，并转染293细胞，通过QRT-PCR方法检测水牛LBP基因在29

5、3细胞中的表达。结果发现，分别克隆得到的水牛、黄牛LBP基因序列，二者同源性为98％。mRNA水平上检测到LBP基因在293细胞中可表达。水牛LBP基因成功提交到GenBank(JQ390223)。2。针对水牛LBPCDS序列设计2条shRNA序列，并构建其慢病毒表达载体，命名为pSicoR．GFP．shLBP774／1212，PCR和测序鉴定重组质粒，QRT-PCR检测shRNA的抑制效率。结果发现，将水牛LBP基因表达载体(靶质粒)与其shRNA表达载体(干扰质粒)以1：3的比例经LipofectamineTM2000脂质体共转染293细胞，shLBP

6、．774，shLBP．1212抑制效率分别为49．53％，29．27％。以上结果表明，筛选得到3条抑制TREMl基因表达的shRNA序列shTREMl94、shTREM294和shTREM578，其中shTREMl94和shTREM294的抑制效率较高达到63．07％$EI79．24％。2条抑制LBP基因表达的shRNA序列shLBP774和shLBPl212，其中shLBP774的抑制效率最高达到49．53％。并分离纯化获得了水牛单核巨噬细胞。关键词：RNAi慢病毒表达载体TREMlCDl4LBP布氏杆菌病IISCREENINGVALIDSHRNASFQ

7、UZNCESOFBUFFALOTREM1ANDLBPGENEIntheimmunetrlggenngexpressionrecepptorABSTRACTresponseselicitedbyonmyeloidcall1jLrltheTLR4．mediatedgram-negativebacteria,，silencingof(TREM1)willaffectCD14genesignalingpathway，inhibitinglipopolysaccharide—bindingprotein(LBP)expressionwillblockLPS／CD14

8、pathwayinLPSrecognitionJsignaling