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1、对已知基因序列的干扰素,基因文库的调用可以用其序列3'端和5'端部分事先用同位素标记过的序列作为探针,通过杂交的方法进行调用。由于干扰素基因的种属特异性不是很大,
2、可以用人的干扰素基因为同源探针,从鼠基因文库中调出相应的干扰素基因,其方法将在下文1中提到。
3、对于扰素基因的取用,不仅可以使用构建基因文库的方法,对已了解其氨基酸或核昔酸割成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的DNA序列,再对其进行表达。化学合
4、成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。与利用基因文库的方法相比,化学合成法比较
5、复杂,由于每加入一个核昔酸就会有一定比
6、例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况,并且在l整个合成过程中这种错误不断积累,因此该方法适合比较短的基因,而对长的基因则有目的产
7、物含量低、产物纯化困难的缺点。但它也有优点,如可根据研究的需要对一些氨基酸进行定点
8、突变,或根据宿主菌的特性,在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿主的偏爱密码子,以提高
9、产物的产量。
10、对于不同亚型的干扰素,由于同源性较高,可以用相同的引物从诱导的小鼠细胞系中提取mRNA混合物进行反转录和扩增,然后用亚型特异性探针对CDNA混合物进行Southern印迹,这样便可将序列上相差较小的同种、不同亚型的干扰素基因
11、进行分离,为生产高纯度的单一干扰素提供了方法O三、表达方法随着对干扰素研究的深入,人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的10~40位、78~107位、123~166位的A、B、C区,尤其是位于78和79位的氨基酸对抗病毒
12、活性十分重要。而人IFNt1的121~136位对抗病毒活性作用较大,人IFN子的N端10个集
13、基酸也是保持其活性所必需的。对干扰素结构的了解为更好地构建基因表达奠定了基础。干
14、扰素最初是用其外源序列进行表达的,但近年来的研究表明嵌合表达的干扰素往往优于单一干扰素,因此出现了较多的嵌合表达形式,并取得了
15、较好的效果。1.IFN-α的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、生产周期短、夕阳基因表达量高的优点,同时由于家蚕为真核生物,能对表达产物自行进行糖基化修饰,产生有生物活性的蛋白,并且在产物提取的过程中只要将家蚕进行匀浆,再进行抽提即可,操作上十分方便,因此,它在基因工程领域内被广泛应用。下面便以人IFN,α的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用。用家蚕核型多角病毒BIIINPV体外感染的家蚕传代细胞株BM-N通过噬菌斑法纯化得到BmNPV的τ3亚型。利用从感染脂肪体mRNA制得的CDNA为探针,对其多角蛋白序列
16、进行检验,其中10.5kb的EcoRI片段及3.9灿的HindE片段可与探针杂交,将10.5灿的EcoRI片段克隆到pBR322中,产生质粒pBmE360对其用HindE切,得到3.9kb片段,其中
17、含有多角蛋白全部序列(图123中为黑色框架),将该片段插入pUC9的HindE位点,产生质
18、粒p9H18。将p9H18用EcoRI切后于50UBAL31外切核酸酶缓冲液中23℃水浴10min,更
19、掐锺油油菲如n入07倍他烈的。气mnlAdEDTA终止反应。将截短的p9H18片段用HindEi切,并通过琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb的Hin
20、d皿平头末端片段,将其插入pUC9即p9B310的HindHI-SmaI位点O另外,将pBmE36的3.1峙的HindE片段连接到pUC8上,得到质粒p8H225,用EcoRI及AatE切,得含有多角蛋白基因下游3.1kb基因的3.5kb片段,将其连接到p9H18的4.7kb的EcoRIAatE片段上,产生杂交质粒p89B310,它在启动子下游含有多聚接头(EcoRI、BamHISmaI、SalI、PstI位点)。将从基因文库中用183bp探针调出的在ATG后含有SmaI位点(即有序列CCCGGGATG)的IFNmαJ基因片段连接到
21、p89B310上,便构建成质粒pIFN2B310。将pIFN2B310与病毒基因组DNA便可共转染BM-N细胞系或家蚕幼体,其具体操作如下:向2.5mL含有0.25molACaCl2、10μgBmNPVDNA及65μgpIFN2B310的溶液中加含0.28II1014NaCl、0.7mmoi/LNa2C03、0.7IIIII1014Na2HP04、50mmol/LEfEPE(pH7.1)的缓冲液,进行沉淀。取0.45ml沉淀加至4.5mi含3×106个细胞的培养液中,12h后换液一次,再培养4d,即可得到重组病毒BmIFN2B310
22、。用两个噬菌斑单位的病毒感染3×106个BM-N细胞或用50μL3×105个噬菌斑单位的病毒溶液注人家蚕幼体,培养24h后收集培养液便可得到干扰素。2.IFN-目的表达将人IFN-R基因HimdE片段插人载体pSV2-dhfr中SV4
