水牛α-乳清蛋白全基因的克隆与序列分析

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1、分类号UDC密级武￡蔫i坤手篓夫哮学位论文水牛Ⅱ一乳清蛋白全基因龇克隆与分析_”一一”，田为宇指导教师姓名申请学位级别：论文定稿同期：学位授予单位：学位授予日期：刘建忠教授武汉科技大学化学J．程与技术学院答辩委员会主席评阅人王光辉1=光辉魏庆信武汉科技大学硕士学位论文第1页摘要生物多样性是人类赖以生存和发展的基础，是影响生态系统稳定性的重要因素。家养动物多样性是生物多样性的重要组成部分，也是同人类关系最为密切、最为直接的部分，是长期进化形成的宝贵资源，生物多样性的保护涉及到人类未来的生存与发展。中国是世界上牛品种资源最丰富的国家之一，但由于种

2、种原因，其遗传多样性在逐渐流失。a．乳清蛋白(n．LA)是反刍动物乳汁中的主要蛋白，也是目前研究的热点。在水牛奶的蛋白质组成中。一LA的含量(2．669／L)明显高于奶牛(1．199／L)。因此对这些物种的该基因调控区序列进行比较将为阐明该基因的表达调控机理提供重要的线索。乳腺生物反应器的核心元件是某一种乳蛋白的基因调控序列。目前，o—LA基因5’调控序列是国际上使用率较高、有应用前景的启动序列，具有巨大的开发价值。本研究拟通过PCR扩增的方法克隆水牛的Q．LA基因全部核苷酸序列，并与牦牛和奶牛相应序列进行比较，以揭示该基因的表达调控机理和遗

3、传多样性，为开展以核苷酸同源性为分类依据的动物品种分类及动物起源与进化方面的研究创造条件，同时为开展以牛Ⅱ一LA基因5’调控区作为启动子的乳腺生物反应器研究储备条件。本研究参考相关文献设计4对引物，寡聚核苷酸序列如下：引物1：上游引物5’·TATI'TAGTGGTATTGGTGGTl'GG一3’下游引物5’．TATTCTGTGcTGTC觚TGlT盯G-3’，预计扩增1225bp；引物2：上游引物5’-TCGTCTTTCTITCAGGGGTC一3’下游引物5’．AAcTrC问n魄～Cc触crrAG．3’，预计扩增451bp；引物3：上游引物5’

4、一GAcCAGAAcccrcAarCAAGC．3’下游引物57．CAGAACCAGCAAAGACAGCAG．3’预计扩增1188bp；引物4：上游引物5’一CCAl’AAAGCACrCl．G，rCTG．37下游引物5’一CCTrGl'GGGCI'AccGTl01'A1：3’；预计扩增634bp；分别经61℃，60℃，68℃，61℃退火及30轮循环的PCR程序后克隆了我国水牛a-LA基因的全部核苷酸序列，将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶中回收后克隆在pMDl8-TVector后进行序列测定。根据已测定序列的核苷酸组成与文献报道的牦牛和奶牛该基因的核

5、苷酸序列比较发现，牦牛Q—LA基因与水牛该基因在3038bp的序列中存在86bp的差异，核苷酸序列同源性为97．17％。水牛n—LA基因与奶牛该基因存在75bp的差异，核苷酸序列同源性为97．53％。其中，水牛Q—LA基因5’调控区部分碱基的插入突变和碱基替换可能是导致水牛和奶牛奶蛋白中该蛋白表达差异的主要朦凼。关键词：a一乳清蛋白基因；水牛；PCR扩增；I—J源性分析乳腺生物反应器第11页武汉科技大学硕士学位论文AbstractBiodiversityisthebasisforhumansurvivalanddevelopment，whic

6、hisalsoaveryimportantfactoraffectingthestabilityoftheecosystem．Thediversitiesindomesticanimals，thepartmostdirectlyrelatedwithhumanbeing，areimportantcomponentsofbiodiversity·andarepreciousresourceaccumulatedduringthelongperiodofevolution．Theeffectiveprotectionofbiodiversityi

7、nvolvesinthesurvivalanddevelopmentofhumanbeingsinthefuture．Chinaisoneofthecountriesthathavetherichestanimalbreedresourcesintheworld，butbecauseofavarietyofreasons，theirdiversitiesarereducingvirtually，andavarietyofforeignproteinhavebeenexpressedinthemaIIImaryglandsoftransgeni

8、canimalsdirectedbythe5’regulatorysequenceofbovineQ·lactalbumingene．Inthisstudythea