水牛bmp-15与gdf-9基因5'调控序列的克隆与分析

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1、广西大学硕士学位论文水牛BMP--15与GDF--9基因5'调控序列的克隆与分析姓名：刘金凤申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：石德顺；刘庆友20120628水牛BMP-15与GDF-9基因5’调控序列的克隆与分析摘要为研究水牛BMP．15与GDF．9基因在卵泡发生过程中的表达模式，本研究克隆了BMP一15与GDF．9基因调控序列并进行了细胞水平的表达验证。参照牛的BMP．15与GDF．9基因组序列设计多对引物，以本地水牛基因组DNA为模板，使用PCR的方法获取不同长度的水牛BMP．15

2、和GDF．9基因调控序列片段，经测序正确后插入pEGFP．1载体，构建EGFP报告载体，用于转染不同组织源细胞，以检测调控序列的活性及组织特异性表达情况，结果总结如下：1．克隆获得了水牛BMP．15基因5’调控序列。克隆的序列为4．6kb，包括了BMP．15基因翻译起始位点上游2．8kb和下游1．8kb，序列比对显示翻译起始位点上游序列与黄牛相应序列相似性为98％。为研究不同区段的启动基因转录活性，我们对调控序列进行了分段克隆，获得包括B4．6、BTL、B2．9、B1．6和B1．3五个片段，分别构建pB

3、MP．15．EGFP．1表达载体，分别转染不同类型的细胞，显示只有BTL(．2788～+219)具有明显的启动基因转录活性，在羊促性腺激素释放细胞(LBT2)、水牛卵丘颗粒细胞(BCG)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人卵巢癌细胞(SKOV3)中启动绿色荧光蛋白表达，而在水牛胎儿成纤维细胞和猪胎儿成纤维细胞中无启动EGFP转录的活性。2．克隆获得了水牛GDF．9基因5’调控序列。克隆的序列为3．7kb，包括了GDF．9翻译起始位点上游2．3kb和下游1．4kb，序列同源性比对显示翻译起始位点上游序列与黄牛

4、相应序列相似性高达98％。同样，为研究不同区段的启动基因转录活性，我们对调控序列进行了分段克隆，获得G3．7、GTL、G2．7、G1．1和G1．2l五个片段，并分别构建pGDF．9．EGFP．1表达载体，转染不同类型的细胞显示只有GTL(-2230,---,+89)具有明显的启动基因转录活性，在LBT2细胞、水牛卵丘颗粒细胞、CHO细胞、SKOV3细胞中启动绿色荧光蛋白表达，而在水牛胎儿成纤维细胞和猪胎儿成纤维细胞中无启动EGFP转录的活性。上述结果表明，水牛BMP．15和GDF．9的基因启动活性区域分

5、别位于BTL(．2788"-'+219)和GTL(．2230"----+89)片段内，获得的两片段均可以启动EGFP在LBT2细胞、水牛卵丘颗粒细胞、CHO细胞和SKOV3细胞中的表达，而不能启动EGFP在水牛胎儿成纤维细胞和猪胎儿成纤维细胞中的表达，推测两段调控序列可能为组织细胞特异性启动子。关键词：水牛BMP．15GDF．9调控序列克隆分析CLONINGANDCHARACTERIZATIONANALYSISTHE5’REGULATIONFRAGMENTOFBUFFALOBONEMORPHOGENET

6、ICPROTEIN．15ANDGROWTHDIFFERENTIATIONFACTOR-9GENEABSTRACTTo1nVestlgatetheexpressionpatternofBMP一15andGDF．9geneinwaterbuffaloduringfolliculargenesis，theregulationregionofBMP．15andGDF．9wasclonedandthefunctionoftheDNAfragmentswereverifiedincelllevel．Accordin

7、gtothegenomesequenceofbovine，primersofBMP．15andGDF．9weredesigned．UsingthelocalbuffalogenomicDNAastemplates，differentlengthofBMP-15andGDF·9regulationsequenceswereamplifiedbvPCR．Aftercorrectlysequencinganalyzed，thesefragmentswereinsertedintopEGFP·1vector,a

8、ndEGFPreportervectorsweresuccessfullygenerated．Then．thesevectorsweretransfectedintocellsderivedfromdifferenttissues。theabilityofregulationfragmentsandtissuespecificexpressionprofilesweredetected，resultsasfollowing：1．The5’r