水牛多能性转录因子oct4、sox2和nanog基因5'调控序列的克隆及功能分析

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1、广西大学硕士学位论文水牛多能性转录因子OCT4、SOX2和NANOG基因5'调控序列的克隆及功能分析姓名：张会娜申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：崔奎青；杨素芳201206水牛多能性转录因子OCT4．．础炫和NANOG基因5’调控序列的克隆及功能分析摘要为探讨水牛干细胞多能转录因子OCT4、SOX2和NANOC基因上游序列的转录调控机制，本研究克隆三个多能转录因子基因的5’调控区序列，并构建不同长度的调控序列报告载体，在早期胚胎水平和细胞水平对各调控序列启动转录的活性进行了检测。1．设计特异性引物扩增克隆获得水牛0C74基因5’调控序列，根

2、据其CR4中2A和2B位点同源序列分布选取了一2571bp、一2389bp、一2338bp和一2191bp四个调控序列片段，并分别构建EGFP表达载体。然后应用各调控序列报告载体通过单精子胞质注射(intracytoplasⅢicsperminjection，ICSI)生产转基因猪胚胎，4．5d后荧光显微镜下可见各调控序列均成功启动下游EGFP表达。但转染水牛胎儿成纤维细胞(buffalofetalfibroblasts，BFF)48h后均未观察到荧光。QRT—PCR分析显示，在4．5d猪胚胎细胞中-2571bp片段活性极显著高于其它调控序列(尸<0．01)

3、，一2389bp与-2338bp之间差异不显著(胗0．05)，二者均极显著高于一2191bp(P

4、，随着片段逐步缩短，各调控序列活性呈极显著递减趋势(尸

5、序列均成功启动下游EGFP的表达。转染BFF48h后均可观察到少数细胞发光。QRT-PCR分析发现，在猪4．5d胚胎细胞中各调控序列活性之间差异均极显著(尸0．05)，二者都极显著高于一312bp片段(尸

6、外的CR4参与了猪4．5d胚胎中067"4的转录调控。水牛SOY2基因翻译起始位点上游407b咖60bp是构成SOY2基本启动子不可缺少的部分；一660bp上游分布有潜在的多能细胞特异性和非多能细胞特异性增强子元件。水牛NANOg基因翻译起始位点上游1213bp在水牛囊胚中可以介导NAN06在内细胞团的特异性表达，其中同时分布有潜在的非多能性细胞特异性的调控元件。关键词：水牛067'4SOX2NANOG调控序列克隆．III5’REGULATORYSEQUENCECLONINGOFBUFFALO．PLURIPOTENTIALTRANSCRIPTIONFACTO

7、RS(ocT4，SOX2，NANOG)ANDTHEIRFUNCTIONANALYSISABSTRACTInordertoexplorethemechanismoftranscriptionalregulationofthebuffaloOCT4，SOX2，NANOGupstreamsequence，the5’regulatorysequencesoftheabove-mentionedthreepluripotentialtranscriptionalfactorswerecloned，andtheEGFPreportervectorscontainingr

8、egulatorysequencesofdiffer