调控小麦抗逆相关基因的转录因子的克隆

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1、内蒙古农业大学硕士学位论文调控小麦抗逆相关基因的转录因子的克隆姓名：曹丽霞申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：马庆;马有志2003.5.1摘要对生长lO天左右的小麦幼髓进行干旱诱鼯，处理2小时后。取幼叶提取mRNA，分别构建了GAL4cDNAAD融合表达文库和cDNA文厍。[GAL4cDNAAD融合表达文库的滴度为1×106pfia／ml，随机挑取103个重组克隆：用限制性内切酶EcoRl、Xhol漤讫，统计分毫蓐结果表明撼入片段在200--6000bp之阕，平均插入片段大小为2000bpoJ秘粥酵母革杂交体系迸彳亍筛选，

2、得到一个长度为1608bp的克隆Y82。经Nd3I比较分析，该蛋囱具有完整的开放读码框，长度为762bp，编码254个氨基酸，与植物的蛋白激酶商很高的同源性。BLAST分析表明，Y82与玉米的蜜食亮氨酸序列的跨膜蛋白激酶ltk2的间源性为76％，与大豆类簧鑫受彝激酶RLKt夔同添靛楚67％，与羧南芬豹缀瓣毽结合受露缀鑫激酶wakl基因的同源性为65％，并且具有富含亮氨酸的序列。由此可以推测Y82可能是一个受体蛋白激酶类似物。在GeneBank中检索，结果展示在小麦中尚未发现与Y82有较高阍源性的序列。RLKl激酶在干旱、高盐及低温引

3、起的水分胁追的感受葶器售号传遴中起关键终髑，因踅，本戮究发理豹小麦类受薅蛋鑫激薅可能在求分胁追的感受和信号传递中起作用，对了孵小麦逆境信号的感受帮传递机制有一定意义。／cDNA文库的滴度为1×106pfulml。用引物WAPF和WAPR扩增小麦赘因组Ⅸ《、A，得到一条特黪条带，约180bp。用此特黪带终搽针筛选eDNA文瘁，繁一次簿选褥爨44个鞠瞧亮建，将簿逡缮餮静鬻谯究隆分囊强浚螽迸孝亍第二次筛选。经过两轮筛选得到一个长度为3500bp左右的党隆W6。BLA8T分析表明，W6与水稻的EREBP型转录因子基因有52％的同源性，与烟草

4、DRE结合蛋臼因子的同源性为43％，并具有转录因子的保守域。j～，一一关键濑：小麦：干攀；eDNA文霹：酵母单杂交；原位杂交jCloningofTranscriptionFactorRegulatingStress。ReponsiveRelatedGeneAbstraetAGAL4ADcDNAfusionexpressionlibraryandaphageeDNAlibrarywereconstructedusingmRNAisolatedfromwheatseedlingleat"dehydratedfor2hours．Theti

5、teroftheGAL4eDNAexpressionlibraryiS1×100pfu／ml，and103positiveclonesselectedrandomlyweredigestedwithEcoRIandXhoItoevaluatethequalityofcDNAlibrary．Thesizeoftheinsertedsegmentrangesfrom200to6000bDwithanaverageof2000bp．Theyeastone·hybridsystemwasappliedtoscreentheGAL4eDNAl

6、ibrary，OnepositiveeDNAcloneWaSnamedY82．SearchingthedatabaseusingtheaminoacidsequenceofY82revealedt11atthehomologybetweenY82andpl'antsprotein16naseishigh．Thededueedproteinsequencecontainsacompleteopenreadingfl'alne(oRF)of762bpencoding254aminoacids．BlastanalysisWasperfor

7、medagainstdatabasesinNCBI，andtheresultshowedthatthehomologyiS76％betweenY82andprotein16nase(Zeamays)withleueine·richrepeattransmembraneproteinkinase2(1tlo)，67％Glycinemaxreceptor-likeproteinkinaseI(RLKl)．and65％Arabidopsisthalianawall-aSsociatedreceptor16naSegenes(wakl)．T

8、heY82wasconsideredasaproteinkinase-likegene．ExpressionofRLKlwasinducedbyLowtemperature，drought，andhighsalinity,andRLK