拟南芥抗逆相关泛素连接酶SINA2的调控分析及小麦SINA同源基因的克隆.docx

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1、拟南芥抗逆相关泛素连接酶SINA2的调控分析及小麦SINA同源基因的克隆干旱、盐、极端温度等非生物胁迫严重影响植物的生长和发育。植物在长期的进化过程中形成了复杂而精准的信号网络,可以感知外界信号并做出响应。在非生物胁迫下,植物可以调控胁迫相关基因的表达,从而提高植物的抗性。探究植物胁迫响应机制对于提高植物抗性具有十分重要的作用。植物泛素连接酶参与了多种信号传导途径。SEVENINABSENTIA(SINA)首次在果蝇中被发现,参与果蝇眼睛的形成。SINA是一类含有RING保守域的泛素连接酶,RING保守域对于SINA的泛素连

2、接酶活性具有决定性作用。拟南芥中共发现18个SINA-like蛋白,其中SINA2不含有该家族其它成员共有的RING保守域。本研究以拟南芥为研究材料,探究SINA2在非生物胁迫条件下的响应;通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白,该蛋白在体外具有泛素连接酶活性;通过酵母双杂交系统筛库,获得SINA2的互作蛋白CDKG1,进一步研究SINA2与CDKG1之间的关系;分析CDKG1在非生物胁迫下的响应及其功能;研究同时克隆了小麦SINA同源基因TaSINA1,分析其进化关系及表达特性。主要得到以下结果:1、氨基酸序列比对

3、发现SINA2在N端缺失RING保守域,而含有一个不完全保守的B-box2保守域;进化树分析发现SINA2与其它SINA蛋白的亲缘关系较远,其通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白;His-SINA2在体外可以催化自身泛素化,对于UbcH5a具有特异性。2、SINA2定位在细胞核和细胞质中;在各个器官中均有表达,在花和果荚中的转录水平最高;SINA2在干旱、盐胁迫和ABA处理下的转录水平均有提高;sina2突变体对干旱、盐胁迫和ABA处理十分敏感,发芽率和子叶展开率均明显低于野生型。3、通过酵母双杂交筛库获得SINA

4、2的互作蛋白CDKG1;通过原核表达系统获得MBP-CDKG1,在体外SINA2可以与MBP-CDKG1结合;将表达YFPN-SINA2和YFPC-CDKG1融合蛋白的载体通过农杆菌注射法转化烟草叶片表皮细胞,在细胞核中发现黄色荧光信号。4、CDKG1具有磷酸化活性,在体外可磷酸化SINA2;重组蛋白His-SINA2在原核表达过程中已被磷酸化,λ蛋白磷酸酶可以去除SINA2的磷酸化,而CDKG1可以恢复SINA2的磷酸化水平;CDKG1磷酸化SINA2增强其泛素连接酶活性;去磷酸化的SINA2失去泛素连接酶活性,CDKG1

5、磷酸化去磷酸化的SINA2可以恢复其活性。5、CDKG1含有一个保守Ser/Thr蛋白激酶保守域,与其它物种CDKG1具有较近的亲缘关系,定位于细胞核中;CDKG1在拟南芥幼苗以及根、茎、叶、花和果实中均有表达,在花和果荚的表达量最高;CDKG1受干旱、盐胁迫和ABA处理诱导表达;CDKG1过表达植株在干旱、盐胁迫和ABA处理下的发芽率和子叶展开率明显高于野生型,而cdkg1突变体对于胁迫十分敏感,其发芽率和子叶展开率低于野生型;胁迫相关基因在不同株系中的表达发生了改变。6、比对发现小麦三个SINA同源基因,分别命名为TaS

6、INA1、TaSINA2和TaSINA3。氨基酸序列分析表明小麦三个SINA蛋白N端含有保守的RING保守域;其中TaSINA1定位在细胞核和细胞质中,且该基因受干旱、盐胁迫和ABA处理诱导表达。