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1、橡胶树抗逆相关WRKY转录因子的克隆与功能鉴定我国属于非传统植胶区,低温和干旱是影响我国橡胶树地理分布和天然橡胶产量的主要因素,因此,培育高产抗低温干旱的优良品种对我国橡胶事业发展意义重大。由于橡胶树是多年生木本植物,常规育种周期长,分子生物学和组织培养技术及基因工程技术的发展为橡胶品种改良创造了条件。WRKY转录因子是近二十年来在植物中发现的一类转录因子,它主要参与调控植物的生长发育,以及各种生物和非生物胁迫的响应。病原菌侵染、创伤、各种非生物胁迫(如干旱、低温、高盐、高渗透压等)和植物信号类物质(如水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸等)都能诱导WRKY基因的表达。本研究以低温处理的热研
2、7-33-97为材料,基于本实验构建的橡胶树cDNA文库中WRKY基因的EST片段,通过RACE技术,获得了4个HbWRKY基因,分别命名为HbWRKY1、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4,对其生物学功能进行了研究；并构建植物表达载体,应用农杆菌介导法转化橡胶树愈伤组织。其主要结果如下：1、HbWRKY基因的克隆本研究通过RACE技术,共获得了4个HbWRKY转录因子基因,其中HbWRKY1基因DNA序列全长3780bp,由四个外显子和三个内含子组成,包含一个2211bp的开放阅读框,编码737个氨基酸组成的多肽,含有两个WRKYGQK结构域和两个C2H2锌指结构,属于
3、WRKY基因家族第Ⅰ类。研究发现,HbWRKY1在不同的组织中都存在两种编码框,分别命名为HbWRKY1a和HbWRKY1b。虽然它们编码的肽段长度相同,但结构上有75个氨基酸存在差异。HbWRKY1a理论等电点为6.05,蛋白质的分子量为79.70389KD,HbWRKY1b理论等电点为5.83,蛋白质的分子量为79.6026KD。HbWRKY2基因DNA序列全长2273bp,由六个外显子和五个内含子组成,包含一个1773bp的开放阅读框,所编码的肽段由590个氨基酸组成的多肽,理论等电点为6.36,蛋白质的分子量为63.9419KD,含有一个保守的WRKYGQK结构域和一个C2H
4、2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅱ类中的第Ⅱb亚类。HbWRKY3基因DNA序列全长1255bp,由三个外显子和两个内含子组成,包含个963bp的开放阅读框。所编码的肽段由320个氨基酸组成,理论等电点为4.80,蛋白质的分子量为36.152KD,含有一个保守的WRKYGQK结构域和一个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅱ类中第Ⅱe亚类。HbWRKY4基因DNA序列全长1009bp,由三个外显子和两个内含子组成,包含一个789bp的开放阅读框架,编码262个氨基酸组成的多肽,理论等电点为8.51,蛋白质的分子量为28.8086KD,含有一个保守的WRKYGQK结构域和一个C2
5、H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅱ大类中的第Ⅱa亚类。2、HbWRKY基因启动子区域的克隆与分析对克隆得到的4个HbWRKY基因进行启动子克隆并分析,其主要结果如下：其中HbWRKYl基因扩增获得2319bp的启动子序列,该调控区含有W-BOX、响应高温胁迫和茉莉酸甲酯(MeJA)等多种顺式作用元件；HbWRKY2基因扩增获得1276bp的启动子调控区,该调控区含有W-BOX响.应高温(HSE)和水杨酸(TCA-element)等多种顺式元件；HbWRKY3基因扩增获得1068bp的启动子调控区,该调控区含有W-BOX、伤害响应元件(WUNmotif)、低温响应元件(LTRE)、
6、脱落酸响应元件(ABRE)等多种顺式作用元件；HbWRKY4基因扩增获得708bp的启动子调控区,该调控区含有W-BOX、脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTRE)等多种顺式元件。3、HbWRKY基因的功能分析4个HbWRKY转录因子在橡胶树花中的表达量最高。HbWRKY1基因在各种非生物胁迫下表达水平变化不大,但受低温和ABA的诱导。HbWRKY2基因在叶片中响应干旱、PEG、低温胁迫以及受SA的早期诱导表达；在树皮中响应高盐、低温胁迫以及受ET的诱导表达。HbWRKY3基因在叶片中响应PEG、高盐、低温胁迫,以及受MeJA、SA、ABA、H2O2和ET的诱导表达,在树皮
7、中响应干旱、PEG、低温胁迫以及受MeJA、SA(?)口ET的诱导表达；HbWRKY4基因在叶片中响应干旱、PEG、低温胁迫以及受MeJA、SA、ABA、H2O2(?)口ET的早期应答反应,在树皮中响应NaCl、低温胁迫以及受ET诱导表达,且低温胁迫强烈诱导其表达。HbWRKY2超表达增强了拟南芥植株的耐旱性；在高盐胁迫下,HbWRKY2超表达拟南芥植株提高了拟南芥下游基因AtRD22和AtRD29A的表达水平,增强了植株的耐盐能力；在SA的诱导下,HbW
