转人α-乳清蛋白基因克隆牛中外源基因整合位点的检测及分析

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1、万方数据分类号：Q三垒!密级：公珏单位代码：学号：100862011086转人Q一乳清蛋白基因克隆牛中外源基因整合位点的检测及分析IdentificationofTransgeneIntegrationLociinhumanalpha--lactaibuminClonedTransgenicCattle学位申请人：指导教师：学科专业：学位类别：授予单位：答辩日期：王敬姣李世杰教授微生物与生化药学理学硕士河北农业大学二。一四年五月三十日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论

2、文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑I匕盘些太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：王为知趸签字日期：仍H年(月1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逦j量壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权趔j匕壅些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位

3、论文作者签名：王窃边楚签字日期：加I￥年6月f日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：墨侈互签字日期：％晔年6月)1=1电话：邮编：万方数据摘要lIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlY2668584近些年来，转基因技术和体细胞核移植技术(somaticcellnucleartransfer,SCNT)相结合使得转基因动物的生产效率有了很大的提高，然而外源基因整合到受体染色体上的整合机制还不是很清楚。本研究主要利用TAIL．PCR和JunctionPCR等方法对5头通过SCNT技术得到的转基因克隆牛的整合位点进行克隆，并对整合位点的特征进行了分析，以期为

4、揭示外源基因整合到受体染色体的机制提供依据。所得结果如下：1．应用TAIL．PCR对5头转人Q．乳清蛋白基因克隆牛的外源基因的插入位点的3’侧翼序列进行克隆，得到了26条3’侧翼序列，并依据其特征将其分成A，B和C三种整合类型。2．在26条3’侧翼序列中存在一个共同的特征，即当外源基因整合到受体染色体上时，外源片段的3’均在第15821个核苷酸处发生断裂，并且和染色体上的一段大小为200—300bp左右的未知序列相连，命名为UNl，其中22Top在不同3’侧翼序列中完全一致。而在B和C类型的3’侧翼序列中，发现有另一段未知序列，命名为UN2。3．通过TAIL．PCR未能得

5、到5’侧翼序列，但是通过5’特异引物PCR方法，我们分别得到了样本081223，样本172和样本189的1条5’侧翼序列，与3’侧翼序列结合，构成三个完整的整合位点。在外源基因整合到染色体上的相接处发现了拓扑异构酶I的酶切位点。4．在样本081223中，外源基因整合在牛的1号染色体的基因组克隆中。分析发现外源基因5’端缺失417bp，37端缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成了46bp的染色体缺失，外源基因的3’末端与染色体之间插入了一段262bp的UNl片段。5．样本172中外源基因整合在牛的2号染色体的基因组克隆中，分析发现外源基因5’端缺失482bp，3’端

6、同样缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成了76bp的染色体缺失。外源基因的3’末端与染色体之间插入了一段263bp的UNl片段。6．样本189中外源基因整合在牛的24号染色体的基因组克隆中，分析发现外源基因5’端缺失290bp，3端缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成98bp的染色体缺失。外源基因的3，末端与染色体之间插入了一段266bp的UNl片段。以上研究结果说明，当外源基因插入到受体基因组时，受体染色体发生了复杂的重排，导致了外源基因和受体染色体不同程度的缺失；在不同的转基因样本中，插入位点存在着一定的共同特征，以上研究结果将为探寻转基因插入位点的规

7、律提供重要依据。关键词：转基因克隆牛；人a一乳清蛋白；TAIL—PCR；整合位点；侧翼序列万方数据IdentificationofTransgeneIntegrationLociinhumanalpha-lactalbuminClonedTransgenicCattleMastercandidate：WangJingjiaoMajor：MicrobiologyandBiochemicalPharmacySupervisor：ProfessorLiShijieAbstractInrecentyears，theproduction