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《人转铁蛋白转基因小鼠整合位点研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、1.1.2.2转基因小鼠鼠尾组织DNA的抽提［⑵(1)小鼠生长至21天时剪取1cm尾组织置于1.5mLEP管中，加入10卩1蛋片酶K和400卩1鼠尾组织裂解液与56。C条件下，消化16小时，屮途颠倒混匀。(2)加入等体积酚，振荡，混匀后BOOOrpm,4°C,离心lOmin。(3)取上清液加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),振荡混匀后,13OOOrpm,4°C,离心lOmino(4)取上清液加等体积氯仿/异戊醇(24:1),振荡混匀后，13000rpm,4°C,离心lOmino(5)取上清液加1/10体积3mol/LNaAC及2倍体积冰无水乙醇(于・20°C放置1小时)颠倒混匀后，与
2、混匀室温放置1Omin后13000rpm离心lOmin。(6)80%乙醇洗二次，真空抽干后溶解于200^11TE(pH8.0)中。1.1.2.3转基因小鼠的PCR检测使用引物TF-1,TF・2扩增人转铁蛋白基因一段特异区域(630bp),引物序列见表1-1,引物合成与上海博尚生物技术公司。检测转基因小鼠的PCR反应体系见表1-2.表PCR鉴定转基因小鼠所用引物序列TF-15'-GAGGTAGCAAGCCAATGTGT-3*TF-251-TACGTGGCTCAGGTAAGTCA■丁表1-2转基因小鼠PCR检测反应体系10xPyrobestBuffer2.5pldNTPMixture(each2
3、.5mM)2.0plTF-1(lOOng/pl)1.0plTF-2(lOOng/pl)1.0plGenomicDNA(〜200ng/pl)2.0plPyrobestDNAPolymerase(5U/
4、J1)0.2plddH2O16.3plTotalVolume25.0pl反应条件：94°C5min；(94°Clmin,55°C45sec,72°Clmin)x32个循环;72°C10mino取5pLPCR产物，2%Agarose凝胶电泳检测。1.1.3结果1.1.3.1转基因小鼠后代的培育经原核显微注射法制备的转基因小鼠作为培育对象，将转基因小鼠与正常小鼠交配后，培育形成TF转基因小鼠家系，家
5、系图见图F4代F0代F1代F2代F3代转恳因輝鼠°转圧因雄鼠E正常止堆鼠O正常雄鼠口图1-1TFN-6转基因小鼠家系图Figure1-1Thepedigreediagramofhumantransferrintransgenicmicestrain1.1.3.2转基因小鼠后代PCR鉴定结果以小鼠鼠尾DNA为模板，PCR扩增hTF基因，检测外源基因是否整合。PCR扩增完成后，取取5
6、JLPCR产物，120V电压下，2%Agarose凝胶电泳检测，电泳结果在凝胶成像仪中拍照。电泳结果下图所示：N1352618764bpp>pppp>potb)bbbb)bxoooooo3COOOOOo1(0365
7、432图1-2原代转基因小鼠PCR电泳结果示意图Figure1・2IdentifyingPCRresultsofTFfundertransgenicmiceTF原代转基因小鼠：4,6,7,16,25,31;N:正常小鼠阴性对照;P：TF阳性质粒；M:lOObpmarkerF1-940F1-941F1-944NTFN-4MlOOObp800bp600bp500bp400bp300bp200bp图1-3TFN-4及其后代PCR鉴定结果Figure1-3IdentifyingPCRresultsofTFN-4andoffspringsTFN-4小鼠子一代：Fl-940,Fl-941,Fl-944；
8、N：正常小鼠阴性对照M:1OObpmarkerF1-851F1-853F1-854F1-856NTFN-6MlOOObp800bp600bp500bp400bp300bp图1-4TFN-6及其后代PCR鉴定结果Figure1-4IdentifyingPCRresultsofTFN-6andoffspringsTFN-6小鼠子一代：Fl-851,Fl-853,Fl-854;N:正常小鼠阴性对照M:1OObpmarkerF1-846F1-847F1-849NTFN-7lOOObp8OObp6OObp500bp4OObp3OObp图l-5TFN-7及其后代PCR鉴定结果Figurel-5Ident
9、ifyingPCRresultsofTFN-7andoffspringsTFN-7小鼠子一代：Fl-846,Fl-847,Fl-849;N:正常小鼠阴性对照M:1OObpmarkerF1-110F1-111F1-115NTFN-16MlOOObp800bp600bp500bp4OObp300bp图1-6TFNJ6及其后代PCR鉴定结果Figure1-6IdentifyingPCRresultsofTFN-16
