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《人脂肪细胞因子ctrp4转基因小鼠的构建与研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、人脂肪细胞因子CTRP4转基因小鼠的构建与研究 C1qTNF相关蛋白(C1qTNF-relatedprotein,CTRP)隶属脂肪细胞因子家族,现已确定这个家族有15个成员。其中的脂联素已经具有将近20年的研究历史,在肥胖、II型糖尿病发生、胰岛素抑制,以及在由肥胖引起的慢性炎症发生过程中具有重要的作用,目前研究发现,在代谢与炎症的交叉领域中,CTRP家族发挥了非常重要的作用。 CTRP4(C1qTNF-relatedprotein4)是CTRP脂肪细胞因子家族成员之一,由本室与国家基因组北方中心利用反向生物学的方法,通过DLR(duall
2、uciferasereportassay)平台筛选出的对NF-κB通路具有明显活化作用的一个功能未知的新基因。我们于2011年首次在国际上进行了报道。前期的研究发现人CTRP4重组蛋白在肝癌细胞系HepG2中可以上调IL-6、TNFα的表达,促进STAT3的磷酸化。还可以提高HepG2对化疗药的抵抗,促进细胞的克隆形成。 我们体外研究已经证明CTRP4具有多种重要功能,进一步研究该分子在体内的生理功能及病理作用是十分必要的。为了更深入研究CTRP4体内的作用和机制,我们构建了人CTRP4转基因小鼠,并进行了鉴定,结果表明
3、转基因鼠的构建是成功的。 1、材料和方法 1.1实验动物 CTRP4的转基因小鼠购自中国医学科学院医学实验动物研究所【SCXK(京)2009-0004】。小鼠品系:C57BL/6J,使用级别为SPF级。用于交配的C57BL/6J小鼠均购自维通利华公司【SCXK(京)2011-0012】,遗传背景为表面分子CD45.2阳性。 动物饲养环境:SPF级,北京大学医学部动物部【SYXK(京)2011-0039】。 1.2实验试剂 限制性内切酶XbaI、XhoI等购自TaKaRa公司,KpnI等购自NEB公司;RevertAidFirstStr
4、andcDNASynthesisKit购自Fermentas公司;基因特异性引物由北京擎科生物公司合成;硝酸纤维素膜(NC膜)购自Amersham-Pharmaciabiotech公司;IRDTMye800-偶联的抗鼠或抗兔的IgG二抗购自LICORBioscience公司;聚丙烯酰胺凝胶电泳Marker购自Fermentas;2TAQPCRMASTERMIX购自博迈德公司;RIPA裂解液、PMSF购自碧云天公司;鼠尾裂解液配方:1mol/LTris-HCl5mL;0.5mol/LEDTA2.5mL;NaCl5.844g;10%SDS25mL。
5、 1.3转基因载体构建 真核细胞表达质粒pcDNA3.1-CTRP4-Myc/His由本室构建,pCAGGS质粒由美国Vanderbilt大学吴冠青教授馈赠。克隆方案中,上下游引物具体序列分别为:CTRP4-PCAGGS-F:5-CCGCTCGAGATGCTGCCGCTTCTGCT-3;CTRP4-PCAGGS-R:5-CCGCTCGAGTCAATGATGATGATGATG-3。 1.4转基因鼠的制备: 选用性成熟的野生型C57BL/6J雌性小鼠。腹腔依次注射孕马血清(50U/mL,0.1mL)及人绒毛膜促性腺激素(50U/mL,0.1mL
6、),置于单笼饲养的正常雄性小鼠笼内,取有精栓雌性小鼠输卵管。受精卵置显微镜注射平台M2液滴内,选有原核的受精卵为注射对象,用显微镜操作仪将有目的基因的线性化片段注入小鼠受精卵雄性原核中,再移植到6周龄ICR孕母鼠输卵管中,待其发育后产仔。此项工作由中国医学科学院医学实验动物研究所完成。 1.5鼠尾基因组DNA提取 剪取鼠尾0.5cm左右,用500μL含有0.1mg/mL蛋白酶K的鼠尾裂解液55℃裂解过夜,之后加入300μL饱和NaCl冰浴15min,12000r/min转速室温离心15min,收上清后加入700μL异丙醇颠倒
7、混匀直至形成絮状沉淀,12000r/min室温离心15min后弃上清加入70%乙醇洗涤沉淀,弃乙醇,晾干。50μL水65℃溶解沉淀得鼠尾基因组DNA。 1.6PCR鉴定CTRP4转基因小鼠 以2.5中所述提取的鼠尾基因组DNA为模板,利用pCAGGS载体的启动子序列chickenβ-actin的特异性引物进行PCR扩增。在10μLPCR体系中加入:2PCRMix5μL,ddH2O4μL,PCR上下游引物各0.2μL,模板DNA0.6μL。反应条件为:94℃变性5min,进入循环(94℃变性30s,
8、退火58℃,30s,延伸72℃,30s)。共35个循环,最后一个循环在72℃延伸10min,4℃保存。上游引物为:5-CCCATAGTA
