水牛、猪gcnf和sf-1基因克隆与表达规律的初步研究

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1、分类号——UDC硕士学位论文密级水牛、猪GCNF和SF．1基因克隆与表达规律的初步研究苏节指导教师互德遂巫究员塞4迭友班究员论文答辩日期2Q13玺鱼旦3旦学位授予日期——答辩委员会主席点壶逸数握．广西大学学位论文原创性和使用授权声明ULlllllllLlllIIllllUllllllllillY2407960本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一

2、同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。函不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：指导教师签名：作者联系电话：函、午加l裙加)睁p日期：Z．

3、p，，．彳．厂强强驯；．5．岁电子邮箱：198964717@qq．com水牛、猪GCNF和SF-1基因克隆与表达规律的初步研究摘要生殖细胞核受体(Germcellnuclearfactor，咖)和类固醇生成因子(Steroidogenicfactor1，SF．1)是核受体超家族中的孤儿核受体成员，它们在胚胎发育、性腺分化、内分泌及生殖调控等多个方面发挥十分重要的作用。本研究以本地沼泽型水牛和家猪为研究对象，应用RT-PCR的方法克隆GCNF和SF一1基因的编码区序列，通过qRT-PCR技术分析GCNF和SF．1在不同组织的表达，并应

4、用免疫组化技术对其蛋白在卵巢和睾丸组织的定位进行分析。此外还应用qRT-PCR系统地研究了GCNF和SF．1基因在卵泡发生和早期胚胎发育过程中的表达规律，并从甲基化和miRNA两个层面对其基因表达调控的分子机制进行了探讨。主要研究结果如下：1．GCNF和SF．1基因全长编码区序列片段的克隆。测序结果显示水牛和猪GCNF基因包含全长编码区片段大小分别为1391bp和1572bp，分别编码435和450个氨基酸残基。多重序列比较结果显示，水牛GCNF基因氨基酸序列与猪、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分别为97％、97％、97％、96％和9

5、7％。水牛和猪SF一1基因包含全长编码序列的扩增片段大小分别为1490bp和2002bp，均编码461个氨基酸残基。多重序列比较结果显示，水牛SF'I基因氨基酸与猪、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分别为96％、98％、94％、94％和95％。在氨基酸和核苷酸水平上GCNF和SF-1基因在不同物种中具有较高保守性。蛋白二级结构分析结果显示GCNF和SF．1蛋白主要以p．转角和无规则卷曲为主，其次是昏螺旋，p．折叠较少，两种蛋白均含有锌指结构和配体结合域结构，具备结合DNA特征的典型核受体结构。2．不同组织基因表达谱构建及在性腺组织中的定

6、位。应用qRT-PCR技术，检测了GCNF和sF．1基因在水牛不同组织的表达。结果显示，水牛lGCNF基因在睾丸(相对表达量为24．9±0．02)和卵巢(24．1±0．16)组织表达水平较高，显著高过在皮肤(1．0_0．29)、肾脏(O．77±0．11)、大脑(O．48±0．26)、肝(O．46±0．02)、生殖嵴(O．45±0．02)、肌肉(0．43±0．01)、骨骼(O．31±O．26)和垂体(O．25±0．01)等组织的表达。水牛SF．1在睾丸(17．8±0．16)、卵巢(12．1±0．03)及生殖嵴中(7．7±0．02)表达

7、水平较高，在大脑(3．1±0．01)、肝脏(1．8±0．12)、皮肤(1．8±0．11)和垂体(1．0±0．3)有一定的表达，而肾脏(O．79±0．68)、骨骼(0．65±0．03)和肌肉(0．58±o．18)等组织表达量均较低。免疫组化结果显示GCNF基因在卵巢中原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均呈强阳性且主要在细胞核中表达，在次级卵泡和有腔卵泡中，卵泡膜细胞和壁颗粒细胞呈强阳性，而卵丘细胞和卵母细胞呈弱阳性；SF．1基因在原始卵泡的卵母细胞核中呈强阳性染色，在初级和次级卵泡中的颗粒细胞和卵母细胞中均呈强阳性，在有腔卵泡中

8、，卵丘细胞呈强阳性染色，而在卵母细胞中表达量较弱。在睾丸组织中，GCNF和SF．1蛋白均存在于曲细精管生精上皮的生精细胞中，推测GCNF和SF—l在卵泡发生和精子发生过程中起着重要的作用。3．卵母细胞成熟前后和早期胚胎中的表达谱研究。