猪stra8基因的克隆、表达和体外转染精原干细胞的初步研究

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1、何庆玲猪Stra8基因的克隆、表达和体外转染精原干细胞的初步研究猪Stra8基因的克隆、表达和体外转染精原干细胞的初步研究研究生：何庆玲专业：动物遗传育种与繁殖导师：李碧春教授(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009)摘要精子发生的场所在雄性动物睾丸的曲细精管内，精子由原始精原干细胞经过复杂的精子发生过程而最终形成。这个过程主要包括三个阶段，首先是精原干细胞经过有丝分裂大量增殖成为初级精母细胞。其次，初级精母细胞启动减数分裂形成圆形的精子细胞。最后，精子细胞通过复杂的变态过程形成完整形态的精子。其中减数分裂是生殖细胞

2、特有的方式，是精子发生过程的重要环节。生殖细胞减数分裂的启动与视黄酸(retinoicacid，RA)和其诱导的Stra8(stimulatedbyretinoicacidgene8)基因的表达密切相关。视黄酸(retinoicacid，RA)是维生素A在体内代谢后的主要活性物质。雄性胚胎睾丸的RA活性较低，无Stra8基因的表达使得雄性生殖细胞停留在有丝分裂阶段。外源的RA能够促进体外培养的雄性生殖细胞表达Stra8基因启动减数分裂。雄性动物出生后，Stra8基因的表达启动雄性生殖细胞开始减数分裂，从而进入精子发生的阶段。公

3、猪睾丸精原细胞减数分裂的启动即意味着首次生精波的启动。不同猪种的精子生成时间有较大的差异。因此减数分裂启动时间的早晚对于种公猪的饲养具有重要的经济意义。为了研究Stra8基因在减数分裂启动的功能，本试验对猪Stra8基因cDNA序列进行克隆，并以梅山猪作为试验动物，研究其在猪的各个组织的表达情况，并构建基于EGFP的表达载体，研究其在精原干细胞体外培养过程中的功能，结果如下：1．Stra8基因cDNA全序列克隆。通过克隆Stra8基因的部分序列，用于设计5’RACE和3’RACE的特异性引物，采用PCR方法克隆出Stra8基因

4、的cDNA全序列，将该序列递交Genbank，序列号为JQ965783，将全长为1444bp的全序列递交NCBI的ORFFinder，发现该序列包含147bp的5’端，110lbp的CDS和196bp的3’端，有完整的PolyA尾，但未发现加尾信号AATAAA。编码区编码367个氨基酸，Stra8编码氨基酸一级结扬州大学硕士学位论文构表明该蛋白质的相对分子量约为41．04kDa，理论等电点约为4．59。进一步对Stra8基因所编码的氨基酸进行相关生物信息学预测，通过预测发现在所编码氨基酸序列第3、4和301氨基酸残基处存在3个

5、O．糖基化位点，第9和116位氨基酸处存在2个N．糖基化位点，并且发现13个丝氨酸、6个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点。在NCBI的BlastP搜索与猪Stra8基因编码氨基酸同源的序列，分析Stra8基因编码氨基酸与其他动物Stra8基因CDS阅读框的同源性，猪与小鼠的同源性最高达78．4％，与鸡的同源性最低，仅为45．4％。2．梅山猪Stra8基因时空表达谱的构建。在mRNA水平上，构建Stra8基因的组织表达谱，Stra8基因是一个组织特异性表达的基因，只在公猪的睾丸中表达，而在脑、下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾和卵巢等

6、组织中均无表达。对不同时间段梅山猪睾丸组织Stra8基因的表达量进行荧光定量PCR分析，结果显示Stra8基因的表达量随着梅山猪日龄的变化呈现出上升的趋势，经统计学分析Stra8基因在初生、30、60、90及150日龄梅山猪睾丸中睾丸的表达量分别为O．05、0．16、O．5、0．6t和1，并且存在着一定的差异，且在150d表达量达到最高。毒3．Stra8基因真核表达载体的檬建和亚细胞定位。采用RT-PCR方法，以成年梅要山猪睾丸总RNA为模板扩增s舰8藩因的全长eDNA编码区序列，采用TA克隆技～￡术，将目的片段插入到pMDl

7、9．T载体中，重组的质粒命名为pMDl9．T-Stra8，测序鉴定后，再将其CDS序列插入真核表达载体pEGFP．N1中，重组质粒命名为pEGFP-N1．Stra8，将其转化到体外培养的小鼠成纤维细胞中进行亚细胞定位，发现Stra8蛋白分布在细胞质内，细胞核内无荧光，说明Stra8蛋白属于细胞质表达的蛋白。4．Stra8转染猪精原干细胞表达的初步研究。通过体外培养猪精原干细胞，将重组质粒pEGFP．N1．Stra8转染猪第三代的精原干细胞，通过荧光显微镜观察发现，与重组载体转染NIH．3T3的结果不同的是，该基因所编码的蛋白在

8、猪精原干细胞的细胞质和细胞核内都可见表达，推测其在减数分裂中行使转录因子的功能。关键词：猪；Stra8；基因克隆；表达分析；精原干细胞；何庆玲猪Stra8基因的克隆、表达和体外转染精原干细胞的初步研究IIlPreliminaryStudyonCloningandEpressi