精原干细胞体外基因转染及其移植的初步研究

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1、陈芳：精原干细胞体外基因转染及其移植的初步研究I精原干细胞体外基因转染及其移植的初步研究摘要背景和目的：精原干细胞(spermatogonialstemcells，SSCs)具有自我更新的能力，是雄性动物体内唯一能将遗传信息传递给后代的干细胞。因此，SSCs将会为干细胞生物学、雄性不育治疗、濒危动物保护、转基因动物生产、高产优质家畜培育等研究提供一种新的强有力工具。自1994年Brinster首次建立SSCs移植技术以来，运用这一技术，亦有转基因动物的问世。SSCs移植技术在羊、牛、猪、鸡等动物上取得了较大的进展。然而，由于犬生殖生理及雌性配子结构的特殊性，以传统

2、的原核显微注射法，人类至今未能获得转基因犬；同时，也未见有通过SSCs分离、体外基因转染及移植的方法来制备转基因犬的相关报道。本研究以小鼠为模型，开展SSCs分离、培养、转染及移植的研究，在此基础上，对犬SSCs的分离、培养、转染、移植及无精子症犬模型构建做了探索性的研究，为利用转基因SSCs移植法制备转基因犬奠定了理论和技术基础。研究内容与方法：①实验动物：用作SSCs分离的动物，分别选择7．8日龄的ICR公鼠，4-4．5月龄的公犬。②SSCs的分离：采用0．29／L胶原酶．0．25％胰蛋白酶的复合酶消化法制备单细胞悬液。③SSCs的纯化和培养：以差速贴壁法纯化

3、SSCs，将纯化后的SSCs接种培养于支持细胞饲养层上，并DMEM+IO％胎牛血清+l％谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％双抗+1％丙酮酸钠为基础培养液培养。@SSCs的体外基因转染：以绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为外源基因，采用阳离子聚合物法(含血清体系和无血清体系)和磷酸钙法转染SSCs，比较转染后EGFP的表达情况。⑤无精子症动物模型的构建：小鼠采用腹腔注射不同浓度白消安(20mg／kg、40mg／kg、60mg／kg)的方法筛选消除内源性SSCs的合适浓度；犬采用肌肉注射不同浓度白消安(8mg／kg、12mg／kg、15mg／kg)的方法筛选消除内源性SS

4、Cs的合适浓度。⑥转EGFP基因SSCs的移植：将转染EGFP基因的SSCs移植到白消安消除其内源性生精上皮的受体小鼠／犬睾丸内，并于移植后不同时间段分别切取受体鼠和犬的睾丸，制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察表达情况。并对受体睾丸基因组DNA进行PCR扩增检测。扬州大学硕士学位论文II结果：QSSCs的分离、纯化和培养：7．8日龄是用于小鼠SSCs分离的最佳年龄段，4—4．5月龄是用于犬SSCs分离研究的最佳年龄段；采用0．29／L胶原酶．0．25％胰蛋白酶复合酶消化法消化生精上皮，小鼠和犬SSCs活率分别达至1J97．73％和95．81％；所获得的SSCs经差速

5、贴壁法纯化后纯化率为60．78％(小鼠)和50．86％(犬)；将纯化后的SSCs培养于支持细胞饲养层上，SSCs贴壁时间为培养8h-12h，SSCs呈扁平圆形或卵圆形，大小均一，单个散在或多个成团、链状存在。②SSCs的体外基因转染：磷酸钙法、阳离子聚合物法(含血清体系)和阳离子聚合物法(无血清体系)均可将外源EGFP基因导入SSCs中，并能表达绿色荧光蛋白。磷酸钙法对小鼠和犬SSCs的转染率分别为8．12％和7．96％；阳离子聚合物法(含血清体系)对小鼠和犬SSCs的转染率分别为22．14％和23．69％；阳离子聚合物法(无血清体系)对小鼠和犬SSCs的转染率分

6、别为21．58％和24．01％。③白消安对内源性SSCs的消除：根据动物的健康存活状态及睾丸组织学结构变化等，确定40mg／kg的注射剂量是消除小鼠内源性SSCs的有效剂量；12mg／kg的注射剂量是消除犬内源性生精细胞的有效剂量：④转EGFP基因SSCs的移植结果：小鼠于移植后1w、2w和3w的睾丸冰冻切片上观察到荧光，受体睾丸基因组DNA经PCR扩增后，扩增出]"620bp的特异性条带；犬于移植后在冰冻切片上未见荧光，受体睾丸基因组DNA经PCR扩增后，未观察到特异性条带。结论：本实验成功有效地分离培养了小鼠和犬的精原干细胞，在体外成功地将外源EGFP基因转染

7、Nd,鼠和犬的SSCsl为，并将转基因SSCs移植到无精子症动物模型的睾丸内，在移植后1w、2w和3w的小鼠睾丸冰冻切片上可见荧光，提示有EGFP基因的表达。上述实验为为利用转基因SSCs移植法制备转基因犬奠定了理论和技术基础。关键词：小鼠；犬；精原干细胞：基因转染；移植；无精子症模型陈芳：精原干细胞体外基因转染及其移植的初步研究IIIFundamentalReserchonGeneTransferinV衙oandTransplantationofSpermatogonialStemCellsAbstractBackgroundandPurpose：Spermat

8、ogoni