精原干细胞移植治疗不育大鼠的研究

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1、精原干细胞移植治疗不育大鼠的研究研究生李松导师张卫星教授王瑞教授郑州大学第一附属医院泌尿外科河南郑州450052摘要研究背景及目的男性不育的诊断与治疗是男科学领域的一个难题，目前，男性不育的诊疗水平远远不能满足广大不育患者的要求，且不育症的发病率呈现升高的趋势。近年来，随着精原干细胞移植技术的发展，将为这一难题探索出一种新的治疗方法。精原干细胞(sscs)是哺乳动物成体皋丸生精上皮内唯一可复制的多潜能二倍体细胞，它能在体外分离、纯化、培养、冻存及同体或异体移植。1994年，Brinster实验室l’】首次报道了sscs移植，并证明它在运用于干细胞以及支持细胞、生殖细胞相互关

2、系的研究中是一项技术性的突破。运用该技术不仅能将SSCs从一个动物成功移植到另一个同种属动物体内(同种基因移植)，而且也能移植到不同种属动物体内(异种基因移植)。伴随精原干细胞群的分离培养、富集和冻存的发展及转基因技术的运用，SSCs移植将为治疗雄性不育、生产转基因动物及为不育患者选择基因治疗提供一条新的途径[2]。这项技术将应用于基础科学、人文医学和家畜及野生动物繁殖。精原干细胞具有永生化和多能化潜能，是精子形成的前体细胞，在翠丸微环境中具有增殖和分化的能力。精原干细胞移植为男性不育症的治疗开启了一扇新的大门。本实验中，我们通过比较不同的受体动物处理方法，探索用于精原干细

3、胞移植的受体动物的合适的造模方法，另外探索精原干细胞分离纯化的方法和同种异体精原干细胞的移植方法，并对移植效果做出评价，通过动物实验为将来的临床应用提供理论和技术支持。方法一探讨合适的造模方法将s一n大鼠随机分为7组，每组10只，分别采用钻609oy、8oy、7oy、6oy、6Gy剂量间隔一周照射两次、白消安40tn叭g单次腹腔注射组，另外一组为正常对照组。观察干预后三个月的死亡率，分别于干预后一月、三月取大鼠的辜丸做病理。通过死亡率和辜丸病理情况判断不同剂量钻60照射以及白消安腹腔注射的造模效果，为后续的精原干细胞移植提供合适的受体动物模型。二建立用于移植的不育动物模型取

4、8周龄的s一D大鼠15只，体重200士209，以钻606Gy剂量做全身照射，一周后相同剂量再次全身照射，四周后予以移植。三分离培养精原干细胞取9一10日龄的S一D大鼠的翠丸，采用机械法+两步酶消化法+差速贴壁法提取精原干细胞。断颈法处死大鼠，无菌收集双侧翠丸，置于盛有HBSS的圆盘中，仔细剥除脂肪垫、附攀、皋丸被膜，并以HBSS反复轻缓吹打。将辜丸组织转移至特制小器皿中，皿内盛少量HBSS，用眼科剪将组织剪至粉末状，将粉末状组织转移至已放置搅拌器的青霉素瓶中。加入相当于组织ro倍体积的lm留InlW型胶原酶溶液，在37℃消化15min，并在磁力搅拌器上轻缓搅拌。静置10In

5、in，吸出上清并弃之，向青霉素瓶内加入含0.smg/in1DNasel功25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的复合酶溶液，在37℃消化10min，并在磁力搅拌器上轻缓搅拌。加入FBS终止胰蛋白酶消化，加入HBsS稀释并轻缓吹打。将消化后的细胞悬液分别经200目、400目的筛网过滤后，将细胞悬液收集在离心管内，以l以X时min离心3min。弃上清，加入新鲜配制的完全培养液，调整细胞密度为3xl护个树。将细胞接种至用光学透明纯聚苯乙烯制造的25crnZ细胞培养瓶，在37℃、5%cq培养箱中孵育4h，收集尚未贴壁的悬浮细胞，以IO00r/min离心3min，加入培养液，重新调整细胞

6、密度为3xl护个/ml。四精原干细胞移植到受体动物受体动物选择约8周龄，体重2009左右的s一D大鼠，采用钻606Gy剂量间隔一周照射两次，照射一个月后行精原干细胞移植。(l)大鼠称重后，以10%水合氯醛按照3oom叭g(03mF100g)体重进行腹腔注射麻醉。(2)大鼠取仰卧位，消毒下腹会阴区，取阴囊正中切口长约Zcln，切开阴囊各层，将两侧辜丸拉出阴囊置于纱布上。(3)参照文献方法13]，用lml注射器穿刺一侧辜丸网，注入精原干细胞悬液，另一侧肇丸作自身对照。移植后清洁开放环境中饲养。五移植效果的评价于移植后2个月，切取翠丸，用Bouln，s液(饱和苦味酸水溶液75ml

7、、福尔马林25ml、冰醋酸5ml)固定24h。行苏木精伊红染色，光镜下观察移植组肇丸和对照组皋丸的病理学表现，免疫组化SABC法检测。一t的表达。结果一gGy组于放射后巧天内全部死亡，死亡率为100%;SGy组三个月内死亡4只，死亡率为40%，肇丸大小与对照组相比明显减小，翠丸各级生精细胞明显减少;7Gy、6Gy组三个月内各死亡两只，死亡率20%，两组翠丸大小与对照组相比无明显差异，仅见部分生精细胞层次减少，部分细胞排列紊乱;6Gy间隔一周照射两次组分别于照射后5天15天各死亡一只，死亡率20%，辜丸大小与对照组相