精原干细胞移植技术研究进展

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1、精原干细胞移植技术研究进展胡红梅1李伟2（1井M山大学医学院江丙吉安343000；2井M山大学临床医学院江丙吉安343000）【中图分类号】R699【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）33-0053-02精子发生是男性生殖细胞增殖、分化的过程，始于青春期并维持终生。精原细胞尤其是精原干细胞是持续维持精子发生的关键因素。个体内可因缺乏精原干细胞或放疗、化疗而导致生精细胞发育障碍或产生无功能性精子等原因引起不育。新近发展的精原干细胞移楨技术为研究精子发生机理提供了新的途径。木文简要综述这项技术的发展过程、主要方

2、法以及最新进展和应用前景。1精原干细胞移植技术分类及发展过程精原干细胞同源移楨技术包括自体移楨和同种异体移楨。这项技术始于1994年Brinster等［1］将可育小鼠的精原干细胞注射到不育小鼠的曲细精管使受体鼠产生了只有受精能力的精子并产出了正常后代，这是精原干细胞移植的首次重要突破。Honanmooz等［2】在实验中，将猪的生殖细胞移入自身对侧的睾丸（自体移植）和无关另外一头猪的睾丸中（同种异体移植），结果两者都未对供者的牛.殖细胞发生明显免疫应答，但植入猪睾丸中的小鼠牛.殖细胞却很快被清除，故他们认为免疫耐受现象只限于同源移

3、楨。1996年Clonthier等［3】将大鼠睾丸细胞显微注射到无免疫应答的重度练合免疫缺陷（severe-combinedimmunodeficientmice,SCID）的裸小鼠的睾丸中，睾丸干细胞会继续发育，并产生带有供体细胞种属的精子发生，取得了跨物种产生精子的重大突破。1999年Ogawa等［4］将小鼠的睾丸细胞移植到大鼠的睾丸中获得成功。Sofikitis［5］等认为人类睾丸细胞移入小鼠或大鼠可使25%的受体产生精子，这似乎表明灵长类生殖细胞或多或少比其它非啮齿类、非灵长类种属与啮齿类动物生精小管的微环境更相容。Na

4、pano等［6】发现人的精原干细胞能在小鼠睾丸中至少可以存活六个月，且在移植后第一个月能保持增殖但不能分化。这种现象Ogawa等认为可能是由于小鼠内源性的支持细胞缺乏足够的能力来支持系统发育距离较远的物种。但用睾丸组织块异位移植可部分解决上述问题，2002年Honaramooz等将新生小鼠、猪或羊的睾丸组织块(0.5-lmm3)移植到阉割的裸鼠的背部皮下，结果60%以上的移植物存活，而II体积增大，并最终产生成熟的精子。2移植方法利用显微注射的方法将可育供体的睾丸细胞混合物注入另一不育受体的曲细精管管腔内，从而诱导受体睾丸曲细精

5、管管腔内出现供体精子生成过程。0前提出主要有三种移植方案：第一，直接穿过睾丸被膜注入睾丸网；第二，直接注入曲细精管管腔内。第三，通过成束的输出小管将睾丸细胞混合物注入到睾丸网。这三种方案均可以将供体精原细胞导入小鼠的曲细精管中，但后一种方案更常用。因为通过前两种方案将生殖细胞注入到牛、猴和人的睾丸中，不能成功地由注射位点注入到曲细精管的远端，而用一种超声波引导的睾丸网注射方法进行注射，可以看到在牛的睾丸网注射位点附近的间质区及曲细精管中都冇被注射的生殖细胞。3移植步骤3.1供体动物和受体动物的选择同源移植一般使用主要组织相容性抗

6、原一致的动物，如供、受体鼠都是C57BL/6组织相容性基因型小鼠。供体动物还需带有一定标记物，如转lacZ基因(指导大肠杆菌B-半乳糖苷酶表达的基因)小鼠，lacZ基因可通过x-gal孵育染色之后呈蓝绿色，很容易就可将其鉴别出来。另外，还可用绿色荧光蛋白(GFP),或溴脱氧尿嚼陡核脊(bromodeoxyuridine,BrdU)标记异源移植皮主要考虑受体动物的选择，选用裸鼠作为受体动物，另外，可选取精子形态与受体动物不同的动物作为供体细胞的来源。3.2供体细胞的分离、纯化和准备供体细胞的分离、纯化是提高移植率的至关重要因素。一

7、般多采用二步酶消化法获取申细胞悬液。利用胶原酶消化能将未消散的睾丸间质消散并释放大部分的管周肌样细胞。利用DNase和胰酶的消化可以释放支持细胞和精原细胞。这样就能冇效分离并制备出高产量和存活率高的单细胞悬液。如果供体是成年鼠，还需用percoll不连续密度递度离心法分离纯化其精原干细胞，以提高移植率。最近Sofikitis等提出经抗-B1和抗a6-整合素抗体阳性选择的，免疫磁珠分选的精原干细胞移植可提高在受体睾丸中的克隆率，尤其a6-整合素的阳性表达可以富集到166倍的的精原干细胞。Shinohara等［7］认为富集的精原干细

8、胞可提高克隆率，S1不育突变异种鼠和隐睾模型是富集来源，尤以后者为佳。3.3受体动物的处理过去，受体动物一般是先天不育型和后天施与药物导致不育型两种。先天不育型如显性纯合的斑点小鼠。造成后天不育多使用的是闩消安(bUSulfan)40mg/kg注射处理，或用10