水牛类精原干细胞体外分离培养的初步研究

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1、广西大学硕士学位论文水牛类精原干细胞体外分离培养的初步研究姓名：陈施蓓申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：石德顺；刘庆友20120628水牛类精原干细胞体外分离培养的初步研究摘要为优化水牛类精原干细胞的分离、培养体系，本研究对水牛A型精原细胞分离纯化方法，体外增殖的影响因素及其生物学特性进行了探讨。(1)对3．7月龄本地水牛生精上皮细胞类型进行了研究。结果发现，该时期的睾丸生精上皮主要存在三种类型细胞，即支持细胞、间质细胞和A型精原细胞。A型精原细胞存在于管腔基底膜处，细胞核大、着色较深。免疫组化染色的结果

2、显示，水牛A型精原细胞表达Oct-4、c．kit、PGP9．5、THY-1和】DBA分子标记蛋白。通过RT-PCR也检测到睾丸组织中有Oct-4、c-kit、PG19．5和THY-1基因的表达。(2)列水牛生精上皮细胞的分离纯化方法进行了研究。结果发现，采用胶原酶、胰蛋白酶两步酶消化法消化曲精细管能成功得到大量的睾丸细胞，再通过差异贴壁法结合PercoU不连续密度梯度离心法可分离纯化睾丸支持细胞与A型精原细胞。其中支持细胞表达其特异性波形蛋白，可用饲养层制作。(3)刘水牛A型精原细胞体外培养特征及类精原干细胞特性进行了研究

3、。结果发现，A型精原细胞接种第2天后开始增殖，10-12天左右形成类精原干细胞克隆。克隆呈碱性磷酸酶染色阳性，表达Oct-4、c．kit、PGP9．5、THY-1精原干细胞特异性因子和牛生殖细胞特异表达的凝集素蛋白DBA。(4)捌讨了不同浓度血清和GDNF对A型精原细胞体外增殖效果的影响。结果发现，随着血清浓度的增高，细胞增殖速度加快，形成的DBA阳性克隆数也增多，最适宜血清添加量为2．5％。GNDF对精原细胞分裂增殖和克隆形成数促进作用明显，并呈现一定剂量依赖关系，最适宜添加的剂量为40ngh。。以上结果表明：(1)3-

4、7月龄的本地水牛睾丸可以分离得到A型精原细胞；(2)水J牛A型精原细胞能在体外增殖形成类精原干细胞克隆；(3)在培养液中添加适量的血清和GDNF能促进水牛A型精原细胞的增殖。关键询：水牛A型精原细胞体外增殖培养‘lM【NARYSTUDYoNTHElSoLA=IIoNAND矾CUI肌7REOFBUFFALOSPER削随TOGON认LSTEI坦．LⅡ(ECELLSABSTRACTInordq；rtooptimizetheculturesystemofbuffalospermatogonialstem—likecells，iso

5、lat：】onmethodsandfactorsaffectingtheproliferationofbuffalotypeAspermatogofniainvitrowereinvestigatedinthisstudy．Meanwhile，thebiologicalcharacterist[csofbuffalotypeAspermatogoniawerealsoexamined．(1)Tkbcelltypeof3to7-month-okibuffaloseminiferousepitheliumwasinvestig

6、ateclinthisstudy．Theresultsshowedthattherearethreetypesofcells：Sertolicell}LeydigcellandtypeAspermatogoniainthisstage．TypeAspermatogonialocatedatthebasilarmembrane，hadabigandstaineddarkcellnucleusandlwasexpressedthemarkersOc“，c-kit,PGP9．5，THY-1andDBA．Theexpres,',i

7、onsofOc鲥．，c．kit，PGP9．5，THY-1werealsodetectedinthetestisbyRT-Pc剥．(2)Thbapproachofisolationandpurifybuffaloseminiferousepitheliumcellswassltdied．Theseresultsshowedthatusingatwo—stepenzymaticdigestseminiferouIstubulecouldobtainalotoftestiscells．Throughdifferentadhesi

8、oncombined1IvithPercolldiscontinuousdensitygradientcentrifugationcouldisolateand．[1epuratetheSertolicellsandtypeAspermatogonia．TheSertolicellsexpresseds