神经干细胞体内移植和体外l1转染的研究

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1、第四军医大学博士学位论文神经干细胞体内移植和体外L1转染的研究姓名：孟晋宏申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：鞠躬2000.5.1第四军医大学博士学位论文神经干细胞体内移植和体外L1转染的研究博士研究生孟晋宏导师鞠躬教授MelittaSehachner教授辅导老师UdoBartsch博士(第四军医大学神经科学研究所西安710032)摘要／f哺乳动物中枢神经系统损伤和再生研究是神经科学研究领域＼的热点。中枢神经系统干细胞的研究是这一课题的重要组成部分，它有助于人们认识神经系统的发育过程，探索诱导细胞分化的分子机制，对于神经系统

2、损伤的修复和疾病的治疗具有广阔的l临床、一，7应用前景。j本研究着眼于中枢神经系统干细胞的体外分化、体内／移植和细胞粘连分子L1的体外转染，为神经干细胞(NSCs)的临床应用提供了新的实验证据，同时，为NSCs和L1分子协同作用的研究，提供了新的实验材料。在实验的第一部分，我们成功地从EGFP转基因小鼠的胚胎中分离并培养出脊髓来源的NSCs，对它的最适培养条件进行了摸索。，f结果显示：1)培养液中只有EGF存在时，没有神经干细胞团形成；培养液中只有bFGF存在时，有少量干细胞团形成：培养液中EGF和bFGF同时存在时，干细胞团的数目

3、最多。2)对体外培养不同时期的脊髓NSCs中的细胞成分的鉴定发现：体外培养1—2周时，第四军医大学博士学位论文脊髓NSCs培养物中含有较多的已分化成分；体外培养4周以上时，脊髓NSCs培养物中的分化后成分大大减少，未分化成分所占比例增加。3)对培养4周以上的脊髓NSC分别用含血清培养液+PLL(Poly-L—Lysin)和含生长因子培养液+PLL两种条件进行体外分化实验，发现在两种培养液条件下，细胞的分化趋向基本相同，皆为诱导分化后l天出现GFAP阳性神经元，3天时出现MAG表达，7天时出现B—tubulinlll阳性信号。此外，n

4、estin在诱导分化过程中，表达量随时间延长而减低。4)两种诱导条件下MAG和p-tubulinlII阳性细胞的形态无明显区别，但是在含血清培养液中，GFAP阳性细胞胞体较大，形态扁平；在含生长因子培养液中，GFAP阳性细胞的胞体较小，有较长突起。以上结果提示脊髓NSC在含20ng／mlEGF和20ng／mlbFGF的培养液中培养传代4周以上，可以得到含较多未分化成分的干细胞团，这些干细胞团具有多潜能性，可以在适当的条件下分化成为不同类型的神经细胞。r，’7．手’。用这种方法培养白勺

5、神经干细胞团进行了小鼠不同部位的体内’，移植实验

6、。借先将脊髓NSCs移植到野生型小鼠的视网膜，并于手、术后2—4周观察结果。结果显示，1)受体动物接受移植时的年龄对移植细胞的整合能力有很大影响。当受体动物为新生小鼠时(P3)，移植的EGFP阳性脊髓NSCs对受体视网膜发生大量的整合(19例中17例为阳性，整合视网膜面积占视网膜总面积的36．80±21．88％)，整合后细胞大部分分化为MAG阳性(28．18±17．19％)和GFAP阳性细胞(34．29±2t．87％)，少数分化为p-tubulinlII阳性细胞；当受体动物接受移植时的年龄为6周龄时，2—4周后只有少量的脊髓NSCs

7、整合到受体的视网膜中(6／6，21．29±10．59％)，细胞分化为MAG(16．87±8．42％)和GFAP(16．97±7．82％)阳性，但未．2．第四军医大学博士学位论文发现B—tubulinlll阳性细胞；当受体动物的年龄为6月龄时，只有i例发生移植细胞的少量整合(1／7，3．88±10．27％)。2)视网膜切片和间接免疫荧光化学染色观察发现，移植细胞大部分被整合到视网膜的内侧各层，局限于内侧核层的内部，许多细胞在整合的局部开始迁移并且分化，向四周发出突起。一些MAG阳性细胞向神经纤维层发出突起，并且沿视神经节细胞的轴突形成

8、束状的髓鞘。GFAP阳性细胞染色较强，数目较多。只有非常少的细胞表达p-tubulinlII，表达量也较低。这部分结果提示脊髓NSCs被移植到小鼠视网膜后，可以根据局部的环境因素分化成为神经系的3种类型细胞，从体内实验的角度进一步证明了脊髓NSC的多潜能性。f。将脊髓NSCs移植到新生小鼠的大脑侧脑室发现，移植细胞可／以沿侧脑室孔到达对侧侧脑室，并且整合到侧脑室壁。f整合到侧L脑室壁的细胞进而向大脑的深部组织迁移，最明显的一条迁移通路是沿吻侧迁移系统(RMS)到达双侧嗅球，并且在嗅球分化为各种形态的细胞。此外，还有部分细胞整合到胼胝

9、体、纹状体等部位。厂。。／实验的第二部分中我们对不同NSCs的基因转染作了尝试。f被、转染的目的基因为细胞粘连因子Ll。当被转染的靶细胞为原代培养的脊髓NSCs时，脂质体转染法所得的转染效率仅为0．44±0．21％。继而我们对永生化的