牛胎儿成纤维细胞体外培养、转染及其核移植的研究

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1、缩略词表AbbreviationD-PBSDulbecco,sPhosphateBuferedSalineD-PBS(一)Dulbecco'sPhosphateSaline(free-Cat+,MgZ十)GFPGreenFluorescentProteinDMEMDulbecco,sModifiedEagleMediumBSABovineSerumAlbumEGFEpidermalGrowthFactorNBSNewbornBovineSerumDMSODeimethylSulphoxideEGEthyleneGlycolCBCytochalasinB6-DMAP6-Dimet

2、hylaminopurineEDTAEthylenediaminetetra-aceticAcidFSHFollicleStimulatingHormoneHMGHumanMenopausalGonadotrophinHepes4-2-Hydroxyethyl-l-peperazineethanesulphonicacidH-M199Hepes-Medium199.TE.0.25%Trypsin-0.02%EDTA内TE2Tris.HCI-EDTA(pH8.0)PVPPolyvinylpyrrolidoneSOFaaSyntheticOviductFluidsupplement

3、edwithammoacids李扬牛胎儿成纤维细胞体外培养、转染及其核移植的研究研究论式牛胎儿成纤维细胞体外培养、转染及其核移植的研究中文摘要本文用不同的方法体外培养牛胎儿成纤维细胞，通过FuGENE-6介导，将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞。经过一定浓度的G418筛选，以转基因细胞为核供体，克隆到去核的牛卵母细胞质中，从而构建重构胚。一、牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养1、本研究分别用胶原酶III和TE'(0.25%Trypsin-0.02%EDTA,0.25%胰蛋白酶一0.02%乙二氨四乙酸)成功的分离了牛胎儿成纤维细胞，并对其进行了体外培养

4、。结果发现，38-C,5%COZ，饱和湿度条件下，用TE'消化时间不能过长，时间控制在一小时左右，成纤维细胞生长最旺盛，原代培养时间最短;用工作浓度为1501U/ml胶原酶m，消化时间控制在20小时左右，成纤维细胞生长增殖最旺盛，原代培养时间最短。2、用组织块直接培养也成功的得到了牛胎儿成纤维细胞，实验发现组织块大小对成纤维细胞原代培养至关重要，接种大小范围在1-3mm的组织块成活率最高，并且原代培养时间塌短，成纤维细胞生长旺盛。3、本研究通过绘制生长曲线，可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律:制备检测传至第6代的牛胎儿成纤维细胞染色体，随机抽取26个细胞染色体计数，其中18个核型

5、正常，为2N=60XX，表明所取牛胎儿为雌性。4、分别以DMSO(DeimethylSulphoxide，二甲基亚矾)、甘油、EG(EthyleneGlycol，乙二醇)为冷冻保护剂，并分别用程序化冷冻和手工冷冻法对传至6-12代的牛胎儿成纤维细胞进行冷冻保存，解冻复称，计算细胞内蒙古大学硕士学位论文贴壁率。结果表明在两种冷冻方法中以DMSO为冷冻保护剂，冷冻效果最佳;两种冷冻方法相比，程序化冷冻法冷冻效果明显优于手工冷冻法。二、FuGENE-6介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞1、用6孔细胞培养板每孔接种细胞数为1X10',FuGENE-6用量为611,暴露时间为5h，各孔

6、分别转染不同量(1^r121g)的质粒DNA。结果表明转染效率随DNA剂量的增加而增加，但增加至8陀时，转染效率不再提高。2、为优化FuGENE-6用量，在6孔细胞培养板中每孔接种细胞数为2.6X104,DNA用量固定为3陀，暴露时间为5h。结果表明随FuGENE-6用量增加，转染效率也在增加。3、不同数量的细胞被7陀质粒DNA,611FuGENE-6转染，暴露时间固定为5h。结果表明6孔细胞培养板每孔细胞接种数在2.6-4X1少的区间内转染效率最高。4、为优化细胞暴露于DNA与FuGENE-6复合物的时间，6孔细胞培养板每孔细胞数为2.6X104，质粒DNA用量7陀，FuGE

7、NE-6611,暴露时间从3h到25h。结果表明随暴露时间的延长，转染效率在下降。5,6孔细胞培养板每孔接种细胞2.8X1少，线性化、非线性化DNA6陀，FuGENE-6611，暴露时间固定为4h。结果表明线性化DNA转染效率明显高于非线性化DNA.6、将牛胎儿成纤维细胞按5X1护细胞吼接种于24孔板，然后加入G418使其终浓度t1g1m1)为100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000，结果表明G418终浓度