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《刘伟-----猪耳成纤维细胞的体外培养及EGFP基因的转染》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、上海农业学报2007,23(4):10-13ActaAgriculturaeShanghai文章编号:10003924(2007)041004猪耳成纤维细胞的体外培养及EGFP基因的转染1,211*刘伟,吴华莉,张德福(1上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106;2南京农业大学动物科技学院,南京210095)摘要:优化脂质体Liperfectamin2000转染EGFP(加强型绿色荧光蛋白)至猪耳成纤维细胞的参数,如DNA和脂质体的用量、细胞汇合度、细胞暴露于DNA和脂质体复合物的时间。试验显示:24孔板内1.0gDNA和2.4
2、L脂质体的用量转染效率最高,DNA和脂质体过量会对细胞产生毒性,影响转染效率;细胞汇合85%~90%才能得到较高的转染效率;细胞暴露4h转染效率最高,时间过长反而使转染效率下降。关键词:猪;耳成纤维细胞;绿色荧光蛋白基因中图分类号:S828;S814.8文献标识码:A阳离子脂质体介导转染核酸进入真核细胞的方法是从20世纪80年代中期发展起来的一种转染技[1]术。阳离子脂质体本身带有正电荷,可以将携带负电荷的外源基因导入任意种类哺乳动物的原代细胞[2]或连续培养的细胞,因此是应用较广泛的介导转染方法之一。研究发现影响脂质体转染效率主要有细[3]
3、胞密度、DNA、脂质体的用量、DNA脂质体复合物的暴露时间等等。本研究优化了脂质体介导EGFP转染至猪耳成纤维细胞的条件,旨在为转基因克隆猪研究提供合适的核供体细胞。1材料与方法1.1材料广西巴马香猪耳边缘组织块取自上海市农业科学院畜牧所实验动物中心;DMEM粉末用900mL三蒸水溶解后,添加3.7gL的NaHCO3、0.11gL丙酮酸钠,3.57gLHEPES,66mgL青霉素和100mgL硫酸链霉素,定容至1L,调pH至7.2~7.4,用时加10%FCS;真核表达质粒pEGFPc1由上海农业科学院畜牧兽医研究所李震研究员惠赠,菌
4、种为DH5,为本实验室保存;质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司。DMEM(Gibco,高糖),青链霉素(山东鲁抗医药公司),脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen),其他试剂均为Ameresco公司。1.2方法1.2.1猪耳成纤维细胞的体外培养成年香猪耳部边缘洗净消毒后,剪取3mm4mm的组织块,剪净毛发冲洗干净。将组织块转移到青霉素小瓶中,灭菌剪刀剪至糊状。加少量培养液悬浮组织,预先润湿的弯头吸管将组织均匀地铺在T25培养瓶的底壁上,将铺有组织块的一面向上,加入1.5mL细胞培养液。再放入CO2培养箱,37
5、,5%CO2,湿度100%。培养6~8h后,将培养瓶轻轻翻转,使细胞培养液慢慢浸没组织块,静置培养,待细胞长至90%,用0.25%胰酶消化液消化回收成纤维细胞与上皮细胞的混合物。按一定比例接种至新瓶,传至第3代,得到纯化的耳成纤维细胞,进行转染。1.2.2猪耳成纤维细胞的纯化成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感度不同,成纤维细胞对消化液较上皮细胞敏感,合适的时间可以使成纤维细胞脱壁,而上皮细胞仍然贴在瓶壁上,经过2~3次的消化传代后即可得到纯化的成纤维细胞。1.2.3DNA的制备pEGFc1质粒为4.7kb,含CMV启动子以及Kanr(卡那
6、霉素抗性)。在含卡那霉素的LB固体培养基中培养,挑取阳性克隆于液体LB培养液中过夜培养。参照TIANGEN质粒高纯度小提中量试剂盒说明书提取纯化质粒DNA。分光光度仪测定质粒DNA的纯度和含量,用于细胞转染。441.2.4pEGFPc1的转染将传至第3代的耳成纤维细胞消化110~410个孔接种至24孔板,在转染前一天换成不加抗生素的完全培养基培养,待其汇合至85%~90%处于对数生长期时进行转染。将收稿日期:2006-01-11初稿;2007-10-27二改稿基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2005)第141号];上海
7、市科学技术委员会项目(014909005;04DZ05611);上海市自然科学基金项目(98ZC14025)作者简介:刘伟(1982-),女,硕士研究生,研究方向:动物繁殖与遗传育种*通讯作者,Tel:(021)62200389;Email:zhangdefu10@yahoo.com.cn上海农业学报111.0g质粒DNA稀释在50L无血清的培养液DMEM中;2.4LLipofectamine2000稀释在50L无血清的培养液DMEM中;轻轻混匀,室温静置5min。稀释后的DNA、脂质体(共100L)轻轻混匀,室温
8、静置20min。每孔加入100L混合物,轻轻晃动混匀。37,CO2培养箱培养4~6h,更换培养液(含10%
