猪抑肌素基因剔除成纤维细胞系的建立及体外发育

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1、摘要摘要猪抑肌素基因mybstatin又称GDF-8(growth／differentiationfaztor-8)，属于TGF．母超家族，是具有调控肌肉重量的一种分泌型糖蛋白因子。该基因与骨骼肌总量的调节有关，其基因编码区保守部分的突变将使得肌肉的发育失去负调控作用而导致肌肉肥大。在自然界中存在Myostatin基因突变导致的比利时蓝牛和皮特蒙特牛的双肌表型，该基因的发现，为育种工作者提供了新的科研思路，为进一步提高动物产肉性能提供了有力的事实依据，为分子水平定向育种奠定了坚实的理论基础。因此育种工作者除了可以

2、利用现有的双肌动物进行繁育外，还可以采用基因打靶技术来剔除Myostatin基因，获得转基因克隆动物，以达到改进肌肉质量和重量的目的，为家畜的高质高效生产提供新技术。目前，基因打靶技术已经成为研究基因功能的重要技术之一。它是80年代后半期基于DNA同源重组原理发展起来的一门新技术，是一种定向改变细胞或生物个体遗传信息的实验手段。通过对生物体遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物体内遗传，表达突变性状，从而达到对其基因功能的研究。本实验采用胰酶消化法和组织块法，建立大白猪的胎儿成纤维细胞系；采用脂质体转染法

3、将构建好的打靶载体导入大白猪胎儿成纤维细胞中，并对转染条件：脂质体浓度、质粒微克数、转染时间、G418筛选浓度和维持浓度等条件进行了优化；转染后的大白猪胎儿成纤维细胞采用G418筛选，然后继续用含(3418和GANC的培养液维持筛选；最后采用PCR法鉴定所得细胞株；将所获得的阳性细胞移入去核的猪卵母细胞内，构建克隆胚，进行体外发育。本研究认为，采用胰酶消化法和组织块法均可以很好的建立大白猪的胎儿成纤维细胞系；脂质体4山，质粒2嵋，转染6h为最优转染体系；G418筛选浓度采用300lag／ml，维持浓度采用200p

4、．g／ml，GANC采用2I．unogL的体系为最优筛选体系。经PCR鉴定后，成功的得到了猪抑肌素基因剔除的成纤维细胞系；核移植后获得的重构胚在体外发育至囊胚。关键词猪；抑肌素基因；成纤维细胞；基因打靶；转染：核移植；囊胚VU独创声明独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得1洼!垫遗直墓丝盂蔓挂别直魉鲍：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的

5、同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名；譬抱量．日期：劲哆年占月6日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：髻艳差日期：力帕g年6月6日～一2凶躇V日期：≯心年乡月石日前言—L—,,

6、————————————————I————————————一———II—_——————II鼍1前言1．1Myostatin基因概况1．1．1Myostatin基因的发现增重速度是肉畜的主要经济性状，产肉量高、肉质好一直是育种工作者努力追求的目标。二十世纪末，科学家们就在不断寻找可以促进动物发育的新基因。欧洲的育种工作者发现一些牛比其它的牛肌肉发达，他们就选择性地用这些牛进行杂交以增加后代的肌肉量，并育成了两个非常优秀的肉牛品种一比利时蓝牛(BelgianBlue)和皮埃蒙特牛(Piedmontese)，这两种牛的

7、臀部、大腿、上臂、胸及起支撑作用的中前端肌肉群异常发达，皮下脂肪少，皮肤薄，其骨骼肌的重量较～般的品种牛重20％左右，这种现象被称为双肌现象(Arthur,1995)。从此研究者开始了对双肌现象的深入研究，并发现它们都是由于一种叫myostatin的基因发生了突变，造成这两种动物肌肉超常发达的双肌性状(KambadurR．etal。1997)，这引起了科学工作者的极大兴趣。1997年，美国JohnsHopkins大学的McPherron等根据TGF．B超家族的保守区设计了一对简并引物，用RT-PCR的方法扩增出一

8、个约280bp的新产物，再用这个产物作为探针筛选小鼠的骨骼肌eDNA文库，得到一个eDNA序列。分析表明该eDNA中只有一个开放读码框(openreadingframe，ORF)，共编码376个氨基酸，即Myostatin。在CEO细胞中表达myostatin基因的研究表明，myostatin基因与转化生长因子p(transforminggrowthfactors：TGF