剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立

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1、剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立【关键词】基因敲除；胚胎干细胞；护骨素；骨质疏松［摘要］目的建立护骨素（OPG）基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型，为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础。方法PCR方法扩增两条同源臂，将两条用于同源重组的片段插入XpPNT载体，构建OPG基因敲除打靶载体。线性化及纯化以后通过电穿孔转导小鼠胚胎干细胞，并用G418和Gancyclovir进行双药筛选培养，得到双药抗性克隆后抽提基因组DNA，采用PCR和southern杂交方法确定同源重组的胚胎干细胞克隆。结果经双药筛选得到124个双药抗

2、性克隆，PCR和southern杂交鉴定获得一个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论总之，本研究成功获得了OPG（-/+）杂合子小鼠胚胎干细胞克隆，为进一步通过显微注射及交配育种获得OPG基因剔除小鼠，在活体水平研究OPG基因的功能打下基础，同时也使建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型成为可能。［关键词］基因敲除；胚胎干细胞；护骨素；骨质疏松EstablishingtheheterozygousmodelofOPGgeneknockoutEScellQIAOJianou,ZHOULongnv,NINGGuang,etal.The9thPeo

3、plesHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200232,China［Abstract］ObjectiveToobtainthehomologousrecombinantembryonicstemcell（EScell）withtheirOPGgeneknockedout.MethodsAtargetingvectorpointingtoOPGexon2andalittlepartofintron2wasbuiltwith3.3kbXbal/BamHIfragmentass

4、hortarmand3.9kbNotI/SalIfragmentaslongarmaftertwohomologyarmswasgotbyPCR.ThelinearizedandpurifiedtargetingvectorDNAwastransfectedintoEScellsthroughelectroporationandthensomeoftheseEScelllinessurvivedG418andGancyclovirselection.Twodrugresistantcloneswereexpandedandidentifiedby

5、PCRandSouthernblot.ResultsTotally124twodrugresistantcloneswereharvestedandoneofthemwasconfirmedaspositive.ConclusionTheresultofthisexperimentmadebasisforthefurtherestablishmentoftheOPGknockoutmousemodelandthedeeperstudyofOPGinvivo.［Keywords］knockout;EScell;osteoprotegerin;ost

6、eoporosis骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病，也是影响人类健康的常见病。如何建立一个特异的动物模型是相关领域的一个热点。护骨素（osteoprotegerin,OPG）是近年来发现的具有抑制破骨细胞分化及吸收活性的一种分泌型糖蛋白［1］，属于肿瘤坏死因子受体（tumornecrosisfactorreceptor,TNFR）超家族。研究表明，OPG在骨质疏松症、风湿性关节炎、Paget病以及恶性骨组织疾病（骨肉瘤，巨细胞瘤，转移性癌）等的发病机制、预防和治疗中具有重要作用。本研究利用

7、分子克隆方法，设计并构建针对小鼠OPG基因第2外显子大部分以及部分第2内含子的打靶载体，采用基因打靶的技术手段，剔除小鼠ES细胞OPG基因,为进一步通过显微注射制备OPG基因剔除小鼠模型奠定基础。1材料与方法1.1实验材料载体质粒pBluescriptⅠⅠ(+/-)和XpPNT质粒由上海南方模式生物中心提供，PCR产物克隆载体pGEMTeasy为Promega公司产品。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、随机引物法DNA标记试剂盒,各种Taq酶、PCR相关试剂及RTPCR试剂盒等购自Takara及NEB公司。DNAmarker（100bpladd

8、er，1kbladder，Lamda－HindIIIfragment）购自NEB和Takara公司。蛋白酶K购自上海生工生物工程技术服务