一种抗蛋白酶的植酸酶转基因猪成纤维细胞系的建立

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1、广西大学硕士学位论文一种抗蛋白酶的植酸酶转基因猪成纤维细胞系的建立姓名：陈晓亮申请学位级别：硕士专业：动物营养与鉰料科学指导教师：王士长；林秀坤201206一种抗蛋白酶的植酸酶转基因猪成纤维细胞系的建立摘要植酸酶可以有效的解决单胃动物高磷粪便污染的问题，然而在饲料加工过程中却容易失活，添加效果不能令人满意。随着转基因技术的发展，通过单胃动物内源性生物反应器产生植酸酶成为解决这一问题有效方法。但是目前实验室产生的转基因猪植酸酶基因appA来源于大肠杆菌，是酸性植酸酶，易在肠道碱性条件下失活，植酸酶在猪消化

2、道作用时间太短。本试验旨在获得对胃蛋白酶和胰蛋白酶都具有耐受性的植酸酶转基因猪成纤维细胞系，为下一步培育更加优良的植酸酶转基因猪的奠定基础。本实验研究主要内容和结果如下：1．验证植酸酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性。构建毕赤酵母表达载体pGAPZaA—Cafp，转化野生型毕赤酵母X一33，并通过逐步提高培养基Zeocin浓度筛选阳性细胞。将阳性细胞进行液体发酵72h，收集粗酶液，测试该酶分别经pH2．0不同浓度的胃酶和pH7．0不同浓度的胰酶处理2h后的酶活残余量。结果表明，粗酶液经pH2．0胃酶和pH7

3、．O胰酶处理后，残留酶活分别保持在70％以上和80％以上。2．慢病毒包装。构建特异性表达载体，包装慢病毒，将慢病毒包装质粒、包膜质粒、载体质粒共转染293T细胞，24、48、72h收集细胞上清液，经纯化获得病毒颗粒，利用稀释法检测慢病毒滴度，滴度约3．75×107tu／mL。3．植酸酶转基因猪成纤维细胞系的建立。将获得的高滴度慢病毒感染成猪纤维细胞，72h荧光显微镜下观察感染效率，在传第3代时进行流式细胞术分选，转基因阳性细胞率为1．2％。经PCR鉴定，载体整合到基因组上；经RT-PCR鉴定，植酸酶基因

4、在RNA转录水平上有表达。关键词：植酸酶毕赤酵母猪成纤维细胞转基因慢病毒流式筛选ESTABLISHMENToFAANTIPRoTEASEPHYTASETRANSGENICSⅥqNEFIBRoBLASTCELLLINEABSTRACTTheapplicationofphytasecaneffectivelysolvetheproblemofhighphosphoruspollutioninmonogastricanimalsfecal．However,itiseasierinactivationinfee

5、dprocessing．Withthedevelopmentoftransgenictechnology,itwillbeaneffectivewaytosolvethisproblemthoughproductingphytasebymonogastricanimalsendogenousbioreactor．Inthegeneratedtransgenicphytasepiggene，thephytasegeneappAisacidicandderivedfromEscherichiacoli．So

6、itiseasierinactivationandplaysarelativeshortroleundertheintestinalgastrointestinalalkalineconditions．Theaimofthestudyistogenerateapepsin．andtrypsin-tolerancetransgenicphytaseswinefibroblastcelllineandlayafoundationforfurtherbreedingtransgenicpig．Thismain

7、resultsinvestigatedareasfollows：1·Thephytasetolerenceofpepsinandtrypsinwasdetected．Apichiapastorisexpressionvector，pGAPZaA—Cafp，wasestablishedandtransformedintothepichiapastorioscellsX一33．PositivecellswereobtainedbyincreasingtheIIIconcentrationofzeocinin

8、mediumgradually．Afterculturingfor72h，fermentationbrothwascollectedtodetecttheenzymeactivityintheconditionofpH2．0underpepsintreatmentandpH7．0undertrypsintreatment，respectively．Resultsshowedthatmorethan70％ofphytaseremainedac