cxcr4基因转染的猪bmscs体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

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1、CXCR4基因转染的猪BMSCs体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究：陈中璞，李拥军，姚玉宇，蒋益波，钱琪，潘啸东【摘要】目的:探讨基质细胞衍生因子1(SDF1)受体CXCR4基因转染的猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导分化为心肌样细胞的可行性。方法：按照Nance方法培养BMSCs，转染带荧光的CXCR4基因，流式细胞仪检测转染后BMSCs的细胞周期，用5氮胞苷(5aza)诱导，并行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化鉴定。对照组为未转染CXCR4基因的BMSCs。结果：体外培养的原代BMSCs10～14d达到融

2、合，CXCR4基因转染后的BMSCs能成功表达CXCR4，转染前后细胞周期无明显改变。与对照组相同，经5aza刺激后，部分BMSCs成梭形，结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化染色均为阳性。结论:CXCR4基因转染的猪BMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持未分化状态,有分化成心肌样细胞的潜能。【关键词】基质细胞衍生因子1;CXCR4基因;骨髓间充质干细胞;体外诱导;心肌样细胞　　[Abstract]Objective:Toinvestigatethepossibilityofinducingporcinebonema

3、rroesenchymalstemcells(BMSCs)yocyteslikecellsinvitro.Methods:BMSCsbonemarroaryandpassageculture.BMSCseter.Afterbeingcoculturedmunohistochemicalstains.Thecontrolgroupeasthecontrolgroup,afterbeingcoculturedeoftransfectedBMSCsbecamespindlelikeandformedayotubule.Myotubular

4、cellsinandTnI.Conclusion:PorcineBMSCspostnatalbonemarroyocyteslikecellsinvitro.　　[Keyalcellderivedfactor1;CXCR4gene;bonemarroesenchymalstemcells;induceinvitro;cardiomyocyteslikecells　　心肌坏死是心血管系统的常见病，其显著特征是功能性心肌细胞大量死亡。一般认为，成熟的心肌细胞是终末分化细胞，缺乏再生能力[1-2]。有研究[3]表明，少数成体心肌细胞在终末分

5、化之后还具有分裂能力，但由于数量极少，不能达到修复损伤心肌的目的。因此，增加心肌细胞或心肌样细胞的数量可以改善此类病人的心功能，细胞移植成为治疗心肌坏死的新策略。然而单纯细胞移植的效率却不高[4-5],为提高移植效率，人们的目光转移到在干细胞的动员、归巢和分化过程中发挥重要作用的细胞因子上。其中，基质细胞衍生因子1(SDF1)与其特异性受体CXCR4相互作用，参与到干细胞动员、归巢、黏附、存活增殖的各个步骤，在心脏的细胞治疗中有着巨大的应用潜能[6-8]。而骨髓间充质干细胞(BMSCs)是全能干细胞分化而来的非造血系干细胞，具有多向分化

6、潜能，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞等[9-12]。因此，将SDF1/CXCR4和BMSCs联合起来，将成为治疗心肌坏死的一个新途径。为此，本研究分离培养猪的BMSCs并转染CXCR4基因，经过流式细胞仪筛选和细胞周期测定后用5氮胞苷(5aza)体外诱导，探讨其分化为心肌样细胞的可行性。　　1材料与方法　　1.1猪BMSCs的体外分离培养和扩增　　按照Nance方法[13]略加改进，选择健康小型猪(出生3～6个月，体质量20～25kg，贵州香猪)，在净化工作室对猪进行无菌的骨髓穿刺术，抽取骨髓液10ml(肝素3000U

7、·ml-1抗凝)，于干细胞研究室行细胞分离。将密度为1.077g·ml-1的FicollPaque分离液加入无菌的离心管中，采集的骨髓液用DMEM以1∶5稀释后加到FicollPaque分离液上，利用密度梯度离心法3000r·min-1离心20min，分离出单个核细胞。细胞计数后以1×106ml-1的浓度接种于加入含10%胎牛血清的完全培养液(包括低糖DMEM，10%胎牛血清，0.25g·L-1两性霉素B)的培养瓶中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，24h后BMSCs即可贴壁，呈纺锤状，更换培养液弃去未贴壁细胞。此后每隔3d

8、换培养液。每天用倒置相差显微镜观察培养瓶中细胞的形态学和组织学变化。约接种10d后，贴壁细胞近乎铺满整个培养皿底，细胞融合达90%时用0.25%的胰酶蛋白(含1mmol·L-1E