医学论文-体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究

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1、医学论文-体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究               作者：黄新江长青肖颖锋万圣祥 【摘要】 目的：观察维甲酸（RA）体外诱导神经干细胞后体内移植治疗失神经肌萎缩的效果。方法：共使用成年SD大鼠28只，切断两侧坐骨神经，随机选择一侧直接吻合坐骨神经作为对照组，实验组从孕龄15d的胚胎SD大鼠脊髓组织中分离获得脊髓源性神经干细胞，经维甲酸（RA）体外诱导后，显微注射到SD大鼠失神经支配的一侧踇长伸肌中，术后16周神经电生理和免疫组织化学等方法观察。结果：实验组与对

2、照组间的踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，神经肌纤维传导速度的数目无统计学差异（P＞0.05）。结论：神经干细胞经体外诱导后体内移植具有治疗失神经肌萎缩的作用。【关键词】 干细胞；维甲酸；胆碱能神经元observetheeffectofinductionofneuralstemcellsinvitroandthentopreventdenervationmuscularatrophyinvivo.MethodsThespinalcord-derivedneuralstemcellsofSDfetalra

3、tsafterpregnant15dayswereharvestedandcultivatedinserum–freemedium,differentiatedandinducedbyRAinvitro,Thenneuralstemcellswererandommicroinjectedintosingleextensorhallucislongusof28SDratswhichweretransectedsciaticnerve,otherschoosenascontrolgroupswhic

4、hwererepairedsciaticnerves,thetwogroupswereexaminedbymuscularelectrophysiologicalexaminationandcellularimmunohistochemistry16weekspostoperatively.ResultsThedifferentsofthemeanpeakofCMAP(extentofmusclefibrillationwaves),themeanNCV（velocityofmusclefibe

5、rnerveconduction）inexperimentgroupandnormalcontrolgroupwasnotstatisticallysignificant(P>0.05).ConclusionsNeuralstemcellsbydiferentiatedintocholinergicneuronsinducedwithRAinvitrocantherapydenervationmuscularatrophyinvivo.   〔KeyWords〕Stemcells;Retinoi

6、cacid;Cholinergicneuron   失神经支配后，骨骼肌立即停止收缩，肌组织失去神经元原来的营养因子，发生萎缩、纤维化、往往再生的神经轴突尚未到达靶肌肉，运终板已经发生碎裂和崩解，导致功能无法恢复，这是外周神经损伤后治疗极为棘手的问题。神经干细胞是一群具有多向分化潜能的原始细胞，在特定的因素影响或诱导下，能向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化[1，2]。将其作为细胞移植材料对中枢神经系统疾病和外伤引起的神经元缺失具有良好效果，而且已有临床应用报道。在2006年8月－2008年

7、2月间，我们利用在体外培养诱导的胎鼠脊髓的神经干细胞移植到SD大鼠切断神经支配的踇长伸肌的上1/3部，观察其在治疗失神经肌萎缩中的作用。   1材料与方法   1.1材料   DMEM/F10（Gibco），B27(Sigma)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，R&D），维甲酸（Gibco），神经元无血清限定性培养基（Gibco），胎牛血清(四季青)，磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsolution，PBS）（Sigma），兔抗大鼠神经上皮干细胞蛋白(nestin)抗体、兔抗

8、大鼠胆碱乙酰转移酶（CHAT）抗体、兔抗大鼠神经胶质酸性蛋白（GFAP）抗体、兔抗大鼠微管相关蛋白–2（MAP2）抗体；FITC标记的羊抗兔二抗和Cy3标记的羊抗兔二抗，荧光显微镜。   1.2胎鼠神经干细胞的体外培养与诱导参照Reynolds等[3]的方法，孕15d的重约250gSD大鼠颈椎脱臼致死，酒精浸泡消毒后移入无菌操作箱，取出胎鼠去头，用显微器械取出脊髓组织，于10倍手术显微镜下去除脊髓外膜，在预冷的D–Hank’S液中用吸管缓慢吹打数次，使其分离成单细胞，将细胞悬液移至离心管中，15