诱导多能干细胞来源的神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究.pdf

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofdoctorTherapeuticeffectsofinducedpluripotentstemcells-derivedneuralstemcellsonratswithexperimentalcerebralhemorrhageByJieQinSupervisor：Prof．YumingXuTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMarch，2014原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位

2、论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作日期：≯，铲年石月／日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采

3、用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作耽日期：砂f妒年6月／日摘要诱导多能干细胞来源的神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究博士研究生：秦洁导师：许予明教授郑州大学第一附属医院神经内科中国郑州450052脑卒中具有高发病率、高死亡率、高复发率和高致残率“四高"特点，是严重威胁人类健康的重大常见疾病。其中，脑出血(ICH)的致死率和致残率比脑缺血高，经常遗留更为严重的持续性神经功能障碍。现有针对I

4、CH的临床治疗手段，包括药物治疗和外科手术治疗，主要目的是支持治疗和防治并发症，缺乏直接针对ICH病理生理所致损伤的有效特异性治疗手段，治疗效果有限。由于神经元的不可再生性、内源性NSCs数量稀少等原因，神经系统在ICH损伤后自身修复的能力十分有限。因此，采用干细胞移植治疗以恢复或重建ICH受损的中枢神经系统的结构和功能，已成为近年来倍受研究者们关注的具有极大应用潜力的治疗方案之一。新现的诱导多能干细胞(iPSCs)技术给ICH治疗带来了新的希望。ICH患者特异的、个体化的iPSCs及其来源的NSCs移植能够避免异体细胞移植面临的免疫排斥和伦

5、理等难题，在治疗难治性ICH方面具有较大应用潜力。本实验研究的目的是首先将重症ICH患者皮肤成纤维细胞体外重编程为iPSCs，接着将iPSCs体外定向诱导分化为NSCs，最后在ICH模型大鼠体内评估iPSCs来源的NSCs移植治疗的效果和可能机制，为利用ICH患者自体iPSCs摘要及其来源的NSCs进行个体化的移植治疗奠定理论和应用基础。第一部分诱导多能干细胞的诱导及鉴定目的：将重症ICH患者皮肤成纤维细胞体外重编程为iPSCs并对其进行体内体外的系列鉴定。方法：①经患者及家属知情同意后，采用钻取活组织检查术采集一名ICH患者4咖n2皮肤样本

6、；②酶消化法分离皮肤成纤维细胞，并进行培养扩增；③使用分别携带人OCT4、SOX2、KLF4和c—Myc基因的慢病毒感染成纤维细胞，使之形成iPSCs样细胞克隆团；④对iPSCs样细胞克隆团进行鉴定：碱性磷酸酶(AP)染色，免疫荧光染色检测表达hESCs特异蛋白Oct4、SOX2、SSEA4、TRA．1—60和Nanog，拟胚体(EB)形成实验体外鉴定其多分化潜能，畸胎瘤形成实验体内鉴定其多分化潜能和体外连续传代检测其自我更新能力。结果：①ICH患者皮肤成纤维细胞被诱导为类ESCs克隆；②类ESCs克隆呈现与hESCs相似的表型和特性：克隆形

7、态相似，AP染色强阳性，持续表达Nanog、OCT4、SOX2、SSEA-4和TRA-1—60等hESCs多潜能标志；③类ESCs克隆具有与hESCs相似的多能性：体外形成EBs并表达三胚层细胞标志AFP、a-SMA、Dcsmin、争HITubulin和GFAP，在SCID鼠肌肉内形成包含三胚层组织的畸胎瘤；④iPSCs具有自我更新能力。结论：ICH患者皮肤成纤维细胞被体外重编程为iPSCs。Ⅱ摘要第二部分体外诱导iPSCs定向分化为NSCs目的：将ICH患者皮肤成纤维细胞来源的iPSCs体外定向诱导为NSCs。方法：首先将iPSCs体外诱导

8、形成EBs，接着将EBs诱导形成神经管样结构，再形成球状NSCs细胞克隆团。对神经球NSCs进行形态、表达Ncstin、自我更新能力和向特定神经细胞定向分化的能力等