体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究

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1、体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究作者：黄新江长青肖颖锋万圣祥【摘要】目的：观察维甲酸（RA）体外诱导神经干细胞后体内移植治疗失神经肌萎缩的效果。方法：共使用成年SD大鼠28只，切断两侧坐骨神经，随机选择一侧直接吻合坐骨神经作为对照组，实验组从孕龄15d的胚胎SD大鼠脊髓组织中分离获得脊髓源性神经干细胞，经维甲酸（RA）体外诱导后，显微注射到SD大鼠失神经支配的一侧踇长伸肌中，术后16周神经电生理和免疫组织化学等方法观察。结果：实验组与对照组间的踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，神经肌纤维传导速度的数目无统计学差异（P＞0.05）。结论：神经干细胞经体外诱导后体内移植具有治疗

2、失神经肌萎缩的作用。【关键词】干细胞；维甲酸；胆碱能神经元observetheeffectofinductionofneuralstemcellsinvitroandthentopreventdenervationmuscularatrophyinvivo.MethodsThespinalcord-derivedneuralstemcellsofSDfetalratsafterpregnant15days–freemedium,differentiatedandinducedbyRAinvitro,Thenneuralstemcellsmicroinjectedintosingle

3、extensorhallucislongusof28SDratsinedbymuscularelectrophysiologicalexaminationandcellularimmunohistochemistry16eanpeakofCMAP(extentofmusclefibrillationeanNCV（velocityofmusclefibernerveconduction）inexperimentgroupandnormalcontrolgroupcellsbydiferentiatedintocholinergicneuronsinduceduscularatroph

4、yinvivo.〔KeyEM/F10（Gibco），B27(Sigma)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，RD），维甲酸（Gibco），神经元无血清限定性培养基（Gibco），胎牛血清(四季青)，磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsolution，PBS）（Sigma），兔抗大鼠神经上皮干细胞蛋白(nestin)抗体、兔抗大鼠胆碱乙酰转移酶（CHAT）抗体、兔抗大鼠神经胶质酸性蛋白（GFAP）抗体、兔抗大鼠微管相关蛋白–2（MAP2）抗体；FITC标记的羊抗兔二抗和Cy3标记的羊抗兔二抗，荧光显微镜。1.2胎鼠神经干细胞的体外培养与诱导参照Reynolds等[3]

5、的方法，孕15d的重约250gSD大鼠颈椎脱臼致死，酒精浸泡消毒后移入无菌操作箱，取出胎鼠去头，用显微器械取出脊髓组织，于10倍手术显微镜下去除脊髓外膜，在预冷的D–Hank’S液中用吸管缓慢吹打数次，使其分离成单细胞，将细胞悬液移至离心管中，1500r/min离心5min弃去上清液，用限定性培养液（内含DMEM/F10、2％B27，20ng/mLbFGF）重悬细胞沉淀，37℃、5％CO2条件下悬浮培养，视细胞生长情况每隔3~5d换液1次。3周后吸取部分神经干细胞的免疫荧光鉴定，检测抗原为Nestin，神经干细胞纯度达到90％。在上述神经干细胞的培养液中加入维甲酸（RA,5μmol

6、/L）后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，分别于3周后取培养细胞应用兔抗大鼠MAP2一抗（1:200），Cy3标志的羊抗兔二抗（1:50），兔抗大鼠GFAP一抗（1:200），FITC标记的羊抗兔二抗（1:50）来检测神经干细胞的分化，再次以小鼠抗胆碱乙酰转移酶(CHAT)抗体双重标记。免疫荧光鉴定，荧光显微镜下观察拍照。1.3体外诱导的神经干细胞体内移植1.3.1动物模型制作200~250g成年健康SD大鼠28只（中山大学实验动物中心提供），质量百分比为1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后消毒铺单。于双侧大腿后外侧行直切口，显露坐骨神经，于中段处切断，实验分两组：随机选择一侧直接吻合修

7、复坐骨神经（对照组），另外一侧显微种植体外培养的神经干细胞悬液于踇长伸肌上1/3部（实验组），术后饲养16周。1.3.2细胞移植、取材与免疫组化鉴定将已经培养的神经干细胞与DMEM培养液混合后制成浓度为105mL悬液，在10倍手术显微镜下应用100μm玻璃筒不锈钢针头显微注射器显微注入干细胞悬液于随机选择的大鼠一侧踇长伸肌上1/3部肌肉组织中，术后单笼饲养16周。16周后分别测双踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，坐骨神经肌纤维神经传导速率后，再次以1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后