2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神经干细胞的实验研究

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1、2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神经干细胞的实验研究【摘要】目的探讨2型重组腺相关病毒（rebinantadeno-associatedvirus2,rAAV-2）载体能否有效地转染NSCs。方法采用含有增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotEin,EGFP）报告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染复数（multiplicityofinfection,MOI）分别为1×104、1×105、1×106转染体外分离、培养的大鼠胎鼠NSCs，在荧光显微镜下观

2、察EGFP的表达；同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况来评估对其存活、增殖、分化能力的影响；当EGFP表达稳定后，流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSCs的转染效率。结果转染10天后各转染组便可观察到NSCs克隆球发出绿色荧光，起始荧光强度不一，随MOI值的增大而增强；各转染组荧光强度随时间的延长而逐渐增强，至转染21天后达高峰并维持，此时流式细胞仪检测rAAV-2对NSCs的转染效率：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%,荧光指数（FI）分别

3、为4.08、12.72、14.06；转染组和未转染组细胞培养7、14、21天时其细胞活力、增殖倍数、分化差异均无显著性。结论rAAV-2能有效地转染NSCs，所介导的目的基因能高效表达。【关键词】神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力【Abstract】ObjectiveToinvestigatethetransfectionefficiencyofrebinantadeno-associatedvirus2（rAAV-2）inculturedneuralstemcells.M

4、ethodsTheneuralstemcellsofratembryocultured,indentifiedinvitroultiplicityofinfection（MOI=0,1×104,1×105,1×106）.Aftertransfection,theexpressionofEGFPicroscope.Atthesametime,thecytotoxicityofrAAV-2toNSCseter.ResultsEGFPcells-drivedneurosphereofalltransfectedgroup

5、s10dfollocellsefficiently,andtherAAV-mediatedtransferofthegenecanbeexpressedintheNSCs.【Keycells；rebinantassociatedadenovirus2;transfection;multiplicityofinfection;greenfluorescentprotein;fluorescentindex；cellvitality绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一种新的报告

6、基因，由于其表达产物GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增强了GFP的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neuralstemce

7、lls，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入［3～5］，寻找NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。1材料与方法1.1病毒载体rAAV-2/EGFP购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为5×1011v.g/ml。1.2神经干细胞分离、培养、鉴定［6］按参考2.3rAAV-2对神经干

8、细胞的转染效率EGFPEGFP开始表达后，于14、21、28天流式细胞仪检测各MOI的rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率（见表4）：可见21天为其表达高峰，此时MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%（见图3），荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。表4不同MOI的rAAV-2/