中华鲟几个生殖细胞相关基因克隆和表达特征的研究

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1、上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检

2、索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注中国科学研究院水童金苟研究员主席生生物研究所吕为群上海海洋大学教授委员罗智华中农业大学教授委员刘红华中农业大学教授委员中国水产科学研究何力研究员委员院长江水产研究所张桂蓉华中农业大学高级工程师秘书上海海洋大学硕士学位论文中华鲟几个生殖细胞相关基因的克隆和表达特征研究摘要中华鲟（Acipensesinensis）为濒危物种，国家一级保护动物；其性成熟期长达10年以

3、上，且发育不同步。虽然其全人工繁殖于2009年已实现，但此种方法需要对其亲本长期养殖，需要投入大量的人力、物力和财力，而且还存在亲鱼死亡等多种风险，因此，有必要寻求其他办法对该物种进行多途径的保护。近年来随着生物技术的快速发展，生殖细胞移植被认为是一种周期短而且有效的方法，在鱼类中有成功应用的报道。该种方法的实施需要首先找到生殖细胞的标记基因。另外，到目前为止，关于中华鲟性别分化、生殖调控的分子机制的相关信息，依然十分有限。鉴于此，本研究通过同源克隆的方法，在中华鲟中得到4个已知在生殖细胞或/和生殖干细胞中起重要作用的基因（pou2、nanos1、dazl和boule）的全长cDNA序列；

4、运用RT-PCR技术，研究它们在中华鲟不同组织和/或不同胚胎发育时期和/或不同年龄性腺中的表达特征。另外，将中华鲟nanos1基因进行原核表达，制备多克隆抗体，运用WesternBlot研究中华鲟Nanos1蛋白在不同组织中的表达；通过免疫荧光定位，研究中华鲟Nanos1蛋白在性腺中细胞的表达部位。主要研究结果如下：1.脊椎动物中，第Ⅴ类POU基因家族成员包括：pou5f1和pou2，其编码的产物为转录因子。该转录因子起着维持胚胎干细胞和生殖干细胞多能性的作用。中华鲟pou2基因（Aspou2）的全长cDNA序列为2853bp，其中开放阅读框为1296bp，编码431个氨基酸，5’非编码区

5、为489bp，3’非编码区为1068bp。通过将AsPou2与其他物种第Ⅴ类POU家族基因氨基酸序列的多重比对，发现第Ⅴ类POU家族成员均含有一个非常保守的POU结构域。AsPou2POU结构域与青鳉的氨基酸序列一致性最高，达到了90%，其次为斑马鱼（88%），爪蟾（69%），小鼠（67%）和人类（67%）。RT-PCR分析发现，除肝脏外，Aspou2mRNA在脾脏、心脏、卵巢、脂肪、肾脏、肌肉、肠、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑都表达，而在肌肉、垂体和脑中的表达量较高。Aspou2为母源表达，且在胚胎发育过程中，其表达量逐渐降低，出膜后一天不表达。另外，还发现随着性腺的发育，Asp

6、ou2的表达量增加。这些结果表明Aspou2可能在体细胞、多能干细胞、胚胎和性腺发育的过程中扮演着重要的角色。2.nanos基因家族成员在种系细胞发育过程中起着重要的作用。本研究通过I上海海洋大学硕士学位论文同源克隆的方法，得到了中华鲟nanos1基因（Asnanos1）的全长cDNA序列。该序列为775bp，开放阅读框为为687bp，编码228个氨基酸，5’非编码区长88bp，没有发现3’非编码区。通过同源比对发现，AsNanos1有一个非常保守的锌指结构域。RT-PCR分析发现，除脂肪外，Asnanos1mRNA在脾、心、卵巢、肝、肾、肌肉、肠、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑中有

7、表达。另外，将AsNanos1原核表达，获得纯化的重组蛋白，免疫家兔，成功制备有效的多克隆抗体。WesternBlot分析发现，除脂肪、肌肉和肠外，AsNanos1蛋白在脾、心、卵巢、肝、肾、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑都表达。这与其mRNA在组织中的表达模式不一致。随后，通过免疫荧光定位，发现AsNanos1在初级卵母细胞和精母细胞的细胞质中表达，并且随着卵巢的发育，其分布在整个初级卵母细胞的细胞质中。这些结果