斑鳜胃蛋白酶原及相关基因克隆和组织表达特征

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1、上海海洋大学硕士学位论文斑鳜胃蛋白酶原及相关基因的克隆与组织表达特征姓名：邓燕飞申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：赵金良20090513上海海洋大学硕士学位论文斑鳜胃蛋白酶原及相关基因的克隆与组织表达特征摘要采用分子克隆技术首次获得了斑鳜(Sinipercascherzeri)3种胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)：PGA1、PGA2和PGC，PGA1和PGC5’侧翼区序列以及胃质子泵(gastricH+心-ATPase)a、口亚基的基因序列，分析了它们在鳃、食道、胃、幽门垂、前肠、后肠、肝胰脏、肾脏、脾脏、心脏、皮肤、肌肉、卵巢和精巢各组织

2、中表达特征，为进一步研究不同PG的时空表达、功能、激活及其转录调控奠定了分子基础，为鱼类消化生理的分子机制研究提供了新的资料。采用RT-PCR和RACE等技术克隆了斑鳜3种PG基因(PGAl、PGA2和PGC)eDNA全长序列和DNA序列，结果表明：PGA1eDNA全长序列1361bp，共编码378个氨基酸；PGA2cDNA全长序列1348bp，编码376个氨基酸；PGCcDNA全长序列1505bp，编码387个氨基酸。3种PG的氨基酸序列均由信号肽、激活肽和胃蛋白酶3个部分组成，序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。斑鳜

3、PGA1与其它鱼类的PGA氨基酸序列相似度在77．8％～94．2％之间，与两栖类、鸟类以及哺乳类则在68．8％～74．4％之间；斑鳜PGA2与其它鱼类的PGA氨基酸序列相似度在77．9％'95．5％之间，与两栖类、鸟类以及哺乳类则在68．5％～72．5％；斑鳜PGC与其它鱼类的PGC氨基酸序列相似度在89．1％"-'92．0％之间，与两栖类、鸟类以及哺乳类则在67．3％"-'87．9％，斑鳜3种PG与其它脊椎动物间的相似度较高(均大于60％)，揭示了它们在进化过程中较为保守。PGA1、PGA2和PGC的DNA序列均由9个外显子和8个内含子组成，除PGC第8

4、内含子剪切位点是GC．AG型外，其它均为GT-AG型。RT-PCR检测了PGA1、PGA2和PGC在各组织中的表达情况，结果显示：3种PG均在食道、胃和皮肤中表达，且主要在食道和胃中表达。此外PGA1还在心脏和精巢中表达，PGA2还在心脏、卵巢和精巢中表达，PGC还在肌肉中表达。为进一步探讨斑鳜不同PG基因的转录调控差异，运用PCR．末端加尾法分别克隆获得了长2437bp的PGA15’侧翼区序列和长1924bp的PGC5’侧翼区序列。结果显示：PGAl和PGC的启动子区域均位于．40一+10bp处，PGAl和PGC的启动子区域均存在TATAbox，而无GC

5、box和CAATbox。在PGA15’侧翼区发现10个HSF和CdxA结合位点，在PGC5’侧翼区发现10个CdxA结合位点，上海海洋大学硕士学位论文此外还发现一些其它转录因子结合位点。由于胃酸的分泌是PG激活的必需条件，因此我们还克隆了斑鳜胃质子泵a、p亚基的cDNA全长序列。结果显示：a亚基cDNA全长3531bp，编码1021个氨基酸，其氨基酸序列含有10个跨膜区，并存在1个赖氨酸／甘氨酸结构簇和1个E1．E2型a亚基转化的磷酸化位点；斑鳜胃质子泵届亚基eDNA序列全长1742bp，编码291个氨基酸，其氨基酸序列由胞质域、膜域和胞浆域3个部分组成，

6、且存在7个N．糖基化位点和6个位置较为保守，形成二硫键的半胱氨酸。斑鳜胃质子泵a亚基与其它鱼类的相似度在92．8％"---94．7％之间，与两栖类和哺乳类的相似度在89．7％～93．2％之间；母亚基氨基酸序列与其它鱼类的相似度在89．1％～92．1％之间，与两栖类、鸟类和哺乳类的相似度在60．1％"--'67．7％之间，说明a、口亚基在脊椎动物长期的进化过程中具有较高的保守性。斑鳜胃质子泵a亚基和口亚基均在食道、胃中有大量表达。其中a亚基除不在肝胰脏和卵巢中表达外，在其它所检测的组织中均表达；．卢亚基则还在卵巢和精巢中有微弱表达。这为进一步研究该基因与PG

7、的协同表达关系与消化功能分析奠定了分子基础。关键词：斑鳜，胃蛋白酶原，PGAl，PGA2，PGC，胃质子泵，a亚基，夕亚基，5’侧翼区，RACE，RToPCR，组织表达lI上海海洋火学硕士学位论文MolecularCloning，CharacterizationandExpressionofPepsinogenGenesandAssociatedGenesfromMandarinFishSinipercaScherzeri(Teleostei：Sinipercidae)ABSTRACTInthisstudy,thecompleteeDNAandpartia

8、lDNAsequencesofthreepepsinogens(P