桑树花青素相关基因的克隆及表达和ans基因表达载体的构建

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1、学校代码：10289分类号：Q5密级：公开学号：122300006江苏科技大学硕士学位论文桑树花青素相关基因的克隆及表达和ANS基因表达载体的构建研究生姓名雷朋导师姓名吴琼英潘刚申请学位类别理学硕士学位授予单位江苏科技大学学科专业生物化学与分子生学论文提交日期2015年4月27日研究方向桑树遗传育种论文答辩日期2015年6月3日答辩委员会主席程嘉翎评阅人2015年6月3日分类号：Q5密级：公开学号：122300006理学硕士学位论文桑树花青素相关基因的克隆及表达分析和ANS基因表达载体的构建学生姓名雷朋指导教师吴琼英

2、副教授潘刚副研究员江苏科技大学二O一五年六月AThesisSubmittedinFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceMolecularcloningandexpressionanalysisofanthocyaningenesfromMulberry(Morusmulticaulis),andConstructionexpressionvectorofANSgeneSubmittedbyLeiPengSupervisedbyAssociat

3、eProfessorWuQiongyingPangangJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJun,2015江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：江苏科技大学学位论文版权使用授权书

4、本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密□，在年解密后适用本授权书。(2)不保密。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日摘要摘要桑树是多年生的重要经济作物，属桑科桑属，是家蚕的唯一饲料。桑树经长期的自然选择和人工选育，形成了丰富的桑树种质资源。但是，与其它植

5、物相比我们在桑树功能基因研究等方面都处于落后状态。因此，研究桑树一些重要的基因及其胁迫环境下的分子作用机制，有利于提高桑叶产量及桑树资源的培养和保存。本文通过抑制消减杂交技术和同源性基因克隆获得了桑树的3个差异显著的ESTs序列，并根据获得的序列结合RT-PCR和RACE技术克隆得到了2个基因的全长cDNA序列。利用胁迫诱导和荧光定量PCR的方法对2个基因进行功能验证和表达分析。同时从桑树中克隆出了ANS基因序列，经过酶切、连接到表达载体1302上，为以后转到拟南芥上进行功能研究做准备。本文主要研究内容如下：（1）桑

6、树紫芽与绿芽的消减抑制杂交花青素与桑树嫩芽的颜色表现有关，桑树中与花青素合成及调节相关的基因很多，本文以桑树紫芽与绿芽为材料，进行消减抑制杂交。所得杂交产物通过琼脂糖凝胶电泳得到差异条带群，可以看到差异显著的三个条带，进行回收测序，得到其中2条条带的EST序列。获得的EST序列经Blast比对和同源性分析，其中一条可能与花青素有关。（2）桑树两个花青素相关基因的全长克隆及胁迫情况下的表达分析从消减抑制杂交中获得的EST序列和从已构建的桑树幼叶cDNA文库得到了一个与花青素相关基因CHS3的一段序列，通过RACE与RT

7、-PCR结合的方法获得了两个基因的全长，并命名为Ma-TCTP（基因登录号：KP228013）和Ma-CHS3。序列分析表明，Ma-TCTP该基因cDNA全长841bp，包括101bp的5′-UTR、233bp的3′-UTR，ORF为507bp,编码168个氨基酸，蛋白质分子质量为18.7362kD,等电点为4.53。同源分析表明，Ma-TCTP基因在各物种间具有很高的保守性。Ma-CHS3该基因cDNA全长1234bp，包括215bp的3′-UTR，ORF为1017bp，编码338个氨基酸，蛋白质分子质量为36.7

8、018kD，等电点为7.58。同源性分析表明，该基因与CHS同族基因序列相似性很高。花青素相关基因不仅与颜色有关，还与植物的抗逆性有关，定量PCR结果表明，Ma-TCTP和Ma-CHS3基因mRNA的转录水平在不同组织及低温、高温胁迫下的均有所不同，但其具体机制还有待进一步研究。（3）桑树ANS基因的表达载体构建从NCBI中已经得到的ANS序列