mtb ag85b199-207、hiv-1env120-128特异tcrs基因共修饰cd8+t细胞及其活性研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文MtbAgs5Bl鲫-207、HIV-1Env怫128特异TCRs基因共修饰CD8+T细胞及其活性研究DevelopmentofgeneticallyengineeredCD8+TcellsexpressingtwoadditionalreceptorsspecificforMtbA9858199-207andHIV一1Envl20．128课题来源：国家自然科学基金(NO：30972680)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员免疫学郝佩佩马骊教授黎诚耀教授陈晓光教授王一飞教授孟民杰教授邓诣

2、群教授论文评阅人董文其教授王菊芳教授2012年5月26日硕士学位论文MtbA985B199-207、HIV-1Envl20．128特异TCRs基因共修饰CD8+T细胞及其活性研究硕士研究生：郝佩佩指导教师：马骊摘要结核菌／艾滋病病毒双重感染(Mtb／HIV双重感染)是结核病和艾滋病防治工作面临的严峻挑战之一，据WHO报道：2010年全球880万新增结核病患者中，有110万(1／8)合并HIV感染，其中约l／3患者病情迅速恶化，短期内发生死亡。目前针对Mtb／HIV双重感染者的治疗主要是抗结核和抗病毒药物治疗，面临服用多种药物、毒副作用大、疗

3、程长、易产生耐药性等问题，因此亟须开发对双重感染者行之有效的治疗方法!Mtb和HIV属于胞内感染病原体，体液免疫难以对其发挥作用，抗Mtb和HIV的免疫机制主要是细胞免疫。Mtb／HIV双重感染者体内存在严重的细胞免疫功能缺陷，主要表现在：效应CD4+Thl(Thelper1)细胞数量极度减少，功能明显下降，IFN吖(interferon—gamma)、TNF．0【(tumornecrosisfactor-a)分泌量减少；效应CD8+CTL(cytotoxicTlymphocytecells)杀伤活性降低，IFN吖、TNF-0【、穿孔素和颗

4、粒酶的分泌明显减少，对致病菌的杀伤活性减弱，不能有效控制疾病。有研究表明，通过过继输注效应T细胞给免疫低下或免疫缺陷的患者，可将保护性免疫传递给受者，增强受者体内效应T细胞对靶抗原的特异性识别及杀伤能力并改善患者的免疫状态。有文献表明，对结核患者过继输注效应T细胞可清除患者体内的结核杆菌。另外，将患者自体体外扩增的CD8+CTL过继输入摘要治疗HIV病人己取得了明显的疗效。但是过继输注效应T细胞治疗Mtb／HIV双重感染者的研究未见报道，原因可能是双重感染者体内效应T细胞数量少，体外分离及大量扩增难度极大，限制了其临床应用。T细胞受体(Tc

5、ellreceptor，TCR)是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的效应分子。近二十年来，有学者分离抗原特异TCR基因并将其转导至初始T细胞中，使该T细胞表达外源TCR并获得特异性识别抗原的能力，通过这一方法，可短期内获得大量抗原特异的效应T细胞，为过继细胞免疫治疗(adoptivecellularimmunothempy，ACT)提供新途径。抗原特异TCR基因修饰T细胞过继输注治疗白血病、转移性黑色素瘤、巨细胞病毒感染、EB病毒感染等疾病已取得了鼓舞人心的治疗效果，被证明是一种有前景的治疗策略。我们之前的研究发现结核38kDa抗原特

6、异TCR基因修饰的CD4+、CD8+T细胞均能特异性识别结核抗原并发挥免疫活性。此外未见有关结核TCR基因修饰的报道。针对HIV抗原特异的TCR基因修饰T细胞的研究也有报道，证明修饰的CD8+T细胞具有良好的抗HIV活性。2011年Blood报道了HofmannC．eta1．等的研究，通过RNA电穿孔他们将两种HIV-1肽特异的TCRs同时转导至T细胞中，并筛选出可同时表达两种外源性TCRs的T细胞，体外实验表明，表达双外源性TCR基因的T细胞具有双特异性，可同时识别两种HIV-1肽，并能分泌效应细胞因子和介导杀伤活性。然而，分离针对TB抗

7、原和HIV抗原特异的TCR基因，并将两种TCR基因同时转染T细胞，检测其对两种抗原的特异性识别能力和免疫活性的研究尚未见报道。TCR基因转导过程中，内源性与外源性TCRGt、B链之间的配对形成的杂合TCR将会稀释转导TCR在T细胞表面的表达，导致细胞表面转导TCR的表达量下降、细胞活性降低。为此，我们采用三种策略来解决错配：1)将MtbA9858199-207特异的TCRa、B链恒定区(constantregion，C)进行最小突变改造：2)将HIV-1Envl20_128特异的TCRcc、D链部分C区替换为完整的CD3‘分子；3)采用3个

8、2A肽段(P2A，T2A，F2A)L至接上述四条基因片段以促使它们均衡表达。据文献报道，将ll硕士学位论文人TCRⅡ、B链C区9个关键位点的氨基酸替换为鼠源性氨基酸(最小突变)可