结核分枝杆菌38kda抗原特异tcr基因修饰inkt细胞及其活性的研究

《结核分枝杆菌38kda抗原特异tcr基因修饰inkt细胞及其活性的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、』jUllllIIIIIIIIIIIlllIIIIIIIIY2525284硕士学位论文结核分枝杆菌38kDa抗原特异TCR基因修饰iNKT细胞及其活性研究硕士研究生：姜振民指导教师：马骊摘要背景结核病(tuberculosis，TB)至今仍是威胁人类健康的主要传染病。近年来，由于人口流动性的增加、结核病控制措施的不完善以及耐药和多重耐药(MDR)结核菌株的产生和流行，导致结核病死灰复燃，成为感染率最高、病死率仅次于艾滋病的传染病。当前我国人口的结核感染率高达44．5％，估算全国活动性肺结核病人500万，位居全球第二位。我国结核病的治疗仍以化疗为主，存在疗程长、毒副作用大等缺点，而

2、且越来越多的结核病患者对抗生素产生耐药性，导致结核病患者久治不愈。因此，亟需开创新的对耐药患者和结核免疫缺陷患者有效的治疗方法!结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)属胞内寄生菌，体液免疫难以对其发挥作用。机体内结核杆菌的清除需要固有免疫应答和适应性免疫应答的协调作用。iNKT细胞作为T细胞的亚群之一，不仅是天然免疫应答和适应性免疫应答的桥梁，而且是机体抗结核感染的第一道防线，在早期的抗结核免疫反应中具有重要的保护作用。结核病灶中的iNKT细胞被活化后，既能释放Y一干扰素(interferon-?，IFN．1，)、肿瘤坏死因子一cc(tumorne

3、crosisfactor．0【，7INF．01)等细胞因子，激活和趋化巨噬细胞，提高其抗原递呈能力和对胞内结核菌的杀灭；又能通过穿孔素和颗粒酶B(granzymeB，GrB)途径直接杀伤感染的靶细摘要胞，发挥细胞毒作用，清除胞内寄生的结核菌。另外，iNKT细胞还参与结核肉芽肿的形成，有效地减少机体损伤，防止结核杆菌的扩散。然而，研究发现感染结核的小鼠体内iNKT细胞数量减少，且iNKT细胞失去免疫效力；在活动性肺结核患者体内亦发现iNKT细胞数量下降、功能被抑制。因此，在结核感染早期提高患者体内iNKT细胞的数量和增强iNKT细胞的抗菌活性可能成为抑制结核杆菌生长的有前景的治疗策

4、略。作为T细胞的亚群，iNKT细胞同样依赖其表面抗原受体(Tcellreceptor，TCR)识别抗原。人iNKT细胞表面的TCR恒定表达Va24J18／VI=ll1，识别抗原谱窄，仅能识别CDld分子递呈的糖脂质抗原；由于结核杆菌表面并不含有CDld分子识别的糖脂质抗原，机体感染结核杆菌以后，iNKT细胞的活化需要依赖于巨噬细胞分泌的内源性糖脂质抗原iGb3。这些限制了iNKT细胞的抗结核活性。因此人为赋予iNKT细胞特异性的抗原识别能力，增加iNKT细胞的抗原识别谱，可以为iNKT细胞应用于早期结核免疫治疗开辟新的途径。目前，抗原特异的TCR基因修饰MHC限制性T细胞和?ST

5、细胞已得到证实。我们在前期也已成功利用结核抗原特异的TCR基因修饰T细胞，并获得良好的抗结核活性。为增强iNKT细胞的抗结核活性并赋予其特异的杀伤能力，我们利用结核杆菌38kDa抗原特异的CD8+T细胞的TCR基因修饰iNKT细胞，使其表达抗原特异的TCR，通过MHC—1分子递呈抗原发挥免疫效应。然而，TCR基因修饰同时仍存在一些问题，通过基因转导的方法使本已表达TCR(Vot24J18／V1311)的iNKT细胞被强制性配备额外的TCRc【、B链，可能导致内外源性TCRa、B错配。因此，细胞表面理论上将存在四种类型的TCR，即内源性TCR、外源性TCR、内源性B与外源性0【错配

6、产生的杂合TCR、内源性n与外源性B错配产生的杂合TCR，因错配的TCR没有经过胸腺的阴性选择，可能具有自身免疫性，且胸腺外尚未发现任何机制可以清除携带自身免疫TCR的T细胞，故内、外源性TCR错配增加了自身免疫的风险。同时，四种类型的TCR将竞争细胞表面恒定量的CD3分子及信号传导系统，稀释了外源硕士学位论文治疗性TCR的作用。在本实验中，为使TCRct、B双链均衡表达和避免内、外源性TCR的错配，我们在不改变TCR功能的前提下，利用2A多肽连接c【、D双链，利用鼠C区的九个氨基酸替换人TCRC区相应位点的氨基酸。之后，利用逆转录病毒载体将改建后的结核38kDa抗原特异的TCR

7、转染到iNKT细胞中，与未转染的iNKT细胞比较，TCR基因修饰的iNKT细胞在体外能特异有效地对38kDa抗原起作用，这些结果表明，TCR基因修饰iNKT细胞被赋予了特异的识别和杀伤活性。目的研究结核抗原38kDa特异TCR基因修饰iNKT细胞体外抗结核活性，为开展结核特异TCR基因修饰iNKT细胞体内抗结核作用研究奠定基础，同时也为其他胞内菌感染、肿瘤、病毒感染等疾病利用iNKT细胞进行免疫治疗提供平台。方法1．筛选结核抗原38kDa特异TCR①淋巴细胞分离液分离健康志愿者外