含结核特异cdr3保守序列tcr基因的构建及其修饰t细胞抗结核活性研究

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1、分类号密缴ＵＤＣ编号？讀似凌硕去学位论文含结核特异ＣＤＲ３巧守序列ＴＣ民基因的构建及其修饰Ｔ细胞抗结核活性研究ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅＫｄＴｃｅｌｌｓＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇＴＣＲｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏｎｓｅｒｖｅｄＣＤＲ３ｓｅｑｕｅｎｃｅｓＳｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＭ化６ｅ／ｒｗ／ｏｓｗ杨植导师姓名马骗教巧专业名称免疫学巧养类型学术型论文提交日期２０１５年５月２７日參南方医科大学２〇ｎ级硕

2、壬学位论文含结核特异ＣＤＲ３保守序列ＴＣＲ基因的构建及其修饰Ｔ细胞抗结核活性研究ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅ村ｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴｃｅｌｌｓＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇＴＣＲｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣＤＲ３ＳｅｕｅｎｃｅｓｑＳｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ课题来源：国家自然科学基金（３０９７２６８０）学位申请人杨植导师姓為马骗教授专业違称免疫学培养类型学术型培养层次硕去研究生所在学院生物技术学院答辩委员会主席陈晓光教授

3、答辩委员会委员王一飞教授黎诫耀教授孙尔维教授邓诣群教授２０１５年５月２８日广州硕去学位论文含结核特异ＣＤＲ３保守序列ＴＣＲ基因的构建及其修饰Ｔ细胞抗结核活性研究硕±研究生：杨植指导教师：马麵摘要背景结核病（ＴＢ）是由结核分枝杆菌化沁■曲ＭＴＢ）弓胞３－的传染性疾病。全球约１／的人曰感染ＭＴＢ，其中约５１０％罹患活动性结核病，每年约９００万例新増活动性肺结核报告。近年来，由于耐多药（ＭＤＲ）和广泛耐药（ＸＤＲ）菌株的流行、人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）与ＭＴＢ伴发感染，使结核病

4、成为死亡人数最高的传染病。传统结核病的治巧仍Ｗ基于抗生素的化疗为主，但由于疗程长、副作用大、Ｗ及耐药性等问题，导致结核病患者久治不愈、治疗效果欠佳。ＭＴＢ属于胞巧寄生菌，，体液免疫难Ｗ对其发挥作用抗结核感染的免疫机＋制主要是细胞免疫，作用最关键的是特异性ＣＤ４Ｔｈ和ＣＤ扩ＣＴＬ。Ｔ细胞过继免疫治疗可作为对结核免疫缺陷患者和耐药患者有效的治疗方法。Ｔ细胞过继免疫治疗是体外培养、扩增、并利用抗原特异Ｔ细胞表面受体（ＴＣＲ）基因修饰Ｔ细胞，赋予Ｔ细胞抗原识别特异性，回输体内从而使机体获得大量效应Ｔ细胞，Ｗ发挥清除Ｍ

5、ＴＢ作用。本研究所已证实ＭＴＢ抗原持异ＴＣＲ基因修饰的＋＋ＣＤ４、ＣＤ８Ｔ细胞在具有良好的抗结核活性。然而，自体Ｔ细胞过继免疫治疗适用范围窄，需针对病例个体进行结核特异性抗原刺激Ｔ细胞、筛选抗原特异Ｔ细胞，建立并筛选Ｔ细胞克隆、抗原特Ｉ中文摘要异性ＴＣ艮构建、基因修饰Ｔ细胞等过程，其筛选的ＴＣＲ基因不具有广泛适用性，，仅针对个体适用且周期长。有研究表明流感病毒、人类疮疹病毒（ＥＢＶ）、人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）和巨细胞病毒（ＣＭＶ）等病毒感染的病例间可观察到ＴＣＲ的偏好取用，即限制性取用特定ａ链可

6、变区基因（Ｖａ）、Ｐ链可变区基因（Ｖｐ）或互补决定区３（ＣＤＲ３）区序列，具有保守的ＴＣ民基因。这些保守ＴＣＲ基因具有高活性及敏感性，对抑制病毒复制起到重要作用。在本研究中，通过ＣＤＲ３谱型分析，找到８６例结核初治患者中保守的ＣＤＲ３序列，从ＧｅｎｅＢａｎｋ中获取高频使用Ｖ基因、Ｊ基因片段，Ｗ及Ｃ基因片段的序列，首次构建含ＣＤＲ３保守序列的ＴＣＲ，对其进行构象预测，进而构建了其重＋＋组逆转录病毒表达载体，制备重组逆转录病毒，转染２例结核患者ＣＤ４和ＣＤ８＋Ｔ细胞，分别与负载灭活Ｈ３７ＲＶ菌株的ＤＣ共培养，检测Ｔ

7、ＣＲ基因修饰ＣＤ４Ｔ＋－－－ＩＦ－细胞的増殖与ＩＦＮＹ、ＴＮＦａ、正４分泌水平，ＴＣＲ基因修饰ＣＤ８Ｔ细胞ＮＹ、－ＴＮＦａ、ＧｒＢ分泌水平，３及其对祀细胞的杀伤作用，证实含结核特异ＣＤＲ保守ＴＣＲ基因Ｔ细胞具有一定的抗结核活性序列的修饰的。目的找到结核特异ＣＤＲ３保守序列，构建含保守序列的ＴＣＲ，研究其修饰患者Ｔ细胞的体外抗结核活性一３，为下步动物实验奠定基础，为含结核特异ＣＤＲ保守序列的ＴＣＲ基因修饰Ｔ细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗提供依据。■ｍ１．撇ＣＤＲ３谱型分析找到雜㈱ＣＤＲ３保守序

8、列①采用淋己细胞分离液分离结核患者和健康志愿者外周血单个核细胞＋＋＋＋（ＰＢＭＣ）分别磁珠分选出ＣＤ４、ＣＤ８Ｔ细胞，提取ＣＤ４和ＣＤ８Ｔ细胞；②＋ｍＲＮＡ，逆转录为