慢病毒介导的taco基因特异性sirna对巨噬细胞抗结核分枝杆菌的影响及其相关机制研究

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1、分类号：密级：UDC：学号：406521012450南昌大学硕士研究生学位论文慢病毒介导的TACO基因特异性siRNA对巨噬细胞抗结核分枝杆菌的影响及其相关机制研究Thestudyoftheimpactsandmechanismsoflentiviralvector-mediatedsiRNAtargetingTACOgeneonthemacrophagesrsisitanceagainstMycobacteriumtuberculosis陈洁培养单位（院、系）：南昌大学公共卫生学院指导教师姓名、职称：

2、李俊明（教授）申请学位的学科门类：医学学科专业名称：临床检验诊断学论文答辩日期：2015年6月5日答辩委员会主席：冯江评阅人：段荣徐江霞2015年6月5日学位论文独创性声明一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论

3、文作者签名（手写）：陈洁签字日期：2015年6月1日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表

4、，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：陈洁导师签名（手写）：李俊明签字日期：2015年6月1日签字日期：2015年6月1日慢病毒介导的TACO基因特异性siRNA对巨噬细胞抗结核分枝杆菌的影论文题目响及其相关机制研究姓名陈洁学号406521012450论文级别博士□硕士√院/系/所公共卫生学院专业临床检验诊断学E_mail备注：√公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要研究目的：构建可表达TACO基因特异性siRNA的慢病

5、毒干涉载体，在此基础上探讨TACO对巨噬细胞清除胞内结核分枝杆菌的影响及相关机制，为后续活体内靶向性抗Mtb感染的研究提供方向和基础。研究方法：1.根据TACO基因的mRNA序列选择3条靶序列，遵照siRNA设计原则设计相应的shRNA,同时设计一条碱基序列被随机打乱的序列作为对照shRNA序列。针对各shRNA分别设计一对单链寡聚脱氧核苷酸，经退火形成相应shRNA表达的双链DNA片段，再通过切分子克隆的方法将其插入shRNA慢病毒表达框架质粒pSicoR，获取四个重组慢病毒表达载体pSicoR-TA

6、CO-siRNA。经酶切及测序鉴定无误后，将其分别命名为pSRT1-4，其中pSRT4为含对照shRNA表达序列的慢病毒表达质粒。2.将重组慢病毒干涉载体（pSRT1-4）同膜蛋白质粒pMD2G与慢病毒包装质粒pSPAX2按一定比例混合包装病毒颗粒，收集可表达相应shRNA的病毒颗粒（分别命名为LV-pSRT1-4）。收集的慢病毒颗粒采用超滤离心管浓缩法进行病毒颗粒的浓缩，再用逐孔倍比稀释法感染293T细胞，通过检测荧光表达细胞个数，进行病毒滴度计算。将包装后的慢病毒以一定比例感染RAW264.7细胞，

7、48h后裂解细胞提取细胞总RNA进行荧光定量PCR检测巨噬细胞内TACO基因转录水平表达情况。再将经慢病毒感染72h的RAW264.7细胞裂解提取细胞总蛋白进行WesternBlot蛋白印迹法，检测巨噬细胞内TACO蛋白的表达情况，筛选干扰效果最佳的重组慢病毒干涉载体。3.分别用LV-pSRT1和LV-pSRT4感染RAW264.7细胞，72h后采用MtbH37Rv分别对这些细胞进行感染，于感染4h后洗去细胞外未被吞噬的细菌并以此时间点计为0h。细胞分别于Mtb感染后0h、24h、48h和72h采用1%

8、triton进行裂解，释放出未杀灭的细菌，经稀释后均匀涂布于M7H10平板，待菌落生长后进行计数，并统计比较各组差异。4.采用AlexaFluor®647染料对MTBH37Rv进行染色，用此染色后的MTB分别对未感染或经LV-pSRT1或LV-pSRT4感染后的RAW264.7细胞进行感染，II摘要24h后，采用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜观察各组细胞内Mtb与溶酶体的共定位情况，探讨下调TACO表达对MTB吞噬体与溶酶体融合率的影响。5