毛囊细胞特异表达胸腺素β4基因转基因绒山羊研究.pdf

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1、分类号UDC学校代码!Q!呈鱼密级编号学号论文题目30808013毛囊细胞特异表达胸腺素p4基因转基因绒山羊研究TRANSGENICCASHMEI冱GoAToFHAIRFoLLICLECELLSSPECIFICEXPRESSIONTHYMoSINBETA4研究生：金永指导教师：刘东军郭旭东研究员专业：动物学研究方向：生殖生物学与生物技术二。一一年六月{『，fl—本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的

2、研究成果，也不包含为获得直蓥直盍堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：：坌鱼刍指导教师签名：日期：趁丝笸：2三E1期：在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产

3、权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。学位论文作者签名：笪鱼三El期．-坐C【．‘：f；指导教师签名日期术。自1997年克隆羊“多莉’’的诞生以来，体细胞克隆技术成为了动物转基因技术研究的热点，并在家畜的转基因生产研究中被广泛的应用。本研究采用了体细胞核移植的转基因方法，即以毛囊特异表达的启动子pKAP6—1引导胸腺素p4(thymosinbeta

4、4，T134)基因，以新霉素抗性基因和红色荧光蛋白基因作为双选择标记，构建毛囊细胞中特异性表达T肛的表达载体；利用体外转染技术将表达载体导入绒山羊胎儿成纤维细胞，通过G418筛选出稳定表达红色荧光蛋白的克隆细胞：以体细胞核移植技术制备绒山羊转基因克隆胚胎；并通过胚胎移植，生产转基因绒山羊。本研究为转基因绒山羊的培育，以及探讨Tp4在绒山羊毛囊发育和生长周期中的调控作用提供了研究基础。1．毛囊细胞特异性表达载体的构建通过PCR和RT．PCR方法分别从绵羊总DNA和绒山羊总RNAq了扩增出角蛋白关联蛋86

5、．1基因(KAP6．1)启动子区序列和绒山羊胸腺素p4(Tp4)编码区eDNA序列，以pMDl9T为克隆骨架构建成中间克隆载体p19TKT。将CMV启动子序列连接在pDsRed2．1表达框架的红色荧光蛋白报告基因(Red2)上游内蒙古大学硕士学位论文rpnI+SmaI位点构成pCDsRed2；pCDsRed2经SacI+Hind1II酶切，与p19TKT的KT片段连接构成毛囊细胞特异表达载体pCDsR．KT。2．绒山羊胎儿成纤维细胞的体外培养及基因转染通过组织块贴附方法成功分离出绒山羊胎儿成纤维细胞，

6、利用脂质体Lip2000TM将构建好的毛囊特异表达载体pCDsR．KT转入绒山羊胎儿成纤维细胞基因组中。再利用G418药物和红色荧光蛋白的表达双重筛选获得阳性细胞克隆，并通过PCR的方法鉴定阳性转基因细胞克隆来源细胞的胎儿性别和外源基因在细胞基因组中的整合情况。通过对转基因／非转基因细胞系生长曲线的绘制与染色体数目的分析，评估转基因细胞活性。成纤维细胞经脂质体转染后筛选，获得了同时具有G418抗性与表达红色荧光蛋白的细胞克隆，外源目的基因已经稳定整合到细胞基因组中，转基因细胞系与非转基因细胞系细胞生长

7、曲线的各个时期特征基本保持一致，两种细胞系的染色体数目正常(2n=60)比率分别为76．7％(23／30)和83．3％(25／30)，两种细胞的染色体数目正常率相近。上述分析表明获得的转基因细胞完全可用于下一步体细胞核移植。3．利用体细胞核移植技术制备转基因绒山羊胚胎以屠宰场绒山羊卵巢为材料，采用切割法收集卵母细胞，并进行体外成熟，成熟的卵母细胞通过显微操作的方法去除核物质并注入转基因体细胞，随后利用电击的方法将二者进行融合形成重构胚胎，重构胚胎经体外激活后体外2金永毛囊细胞特异表达胸腺素B4基因转基

8、因绒山羊研究发育到4．8细胞阶段进行胚胎移植。绒山羊卵母细胞体外成熟率为77．5％，去核存活率为93．6％，重构胚胎的融合率为82．4％，体外发育卵裂率为93．5％，8．细胞率为24．5％，囊胚率为14．3％。PCR鉴定结果表明，外源基因稳定整合于转基因胚胎基因组，荧光显微镜观察红色荧光蛋白在转基因胚胎中稳定表达。为探究绒山羊的体细胞核移植过程中高效的体外激活方法，利用IA23187+6一DMAP，Ionomycin+6一DMAP，7％乙醇+6一DMAP