转基因聚球藻7942光自养培养及人源胸腺素α1表达的研究

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1、华东理工大学博士学位论文第1页转基因聚球旅7942光自养培养及人源脚膝素al表达的研究摘要唤二十年来蓝藻基因工程发展迅速，许多具有“附加值的外源基)z在蓝藻中“得表达，显示了转基因蓝藻在外源蛋白生产方面具有潜在应用价值。高密度高表达培养是转基因蓝藻能否走向应用的关键技术之一，而有关这方面的研究却鲜见报道为本文以转人源胸腺素al(Tal)一泛素融合蛋白基因聚球藻7942这一新的转基因蓝藻光自养培养作为研究对象，对培养过程所涉及的Tal检测方法、外源基因表达条件、培养基优化、光生物反应器培养工艺、动力学及代谢流等进行

2、了较为深入的研究。利用由Tal一小牛血清白蛋白融合蛋白免疫新西兰兔获得的抗体，建立了转基因聚球藻7942细胞内Tal的ELISA测定方法:确定20ml玻璃瓶中Tal的诱导表达条件为:藻细胞OD7300.6，诱导的红光光强3klx,pH9.5，温度300C，诱导时间3ho利用Plackett-Burman实验设计和中心组合旋转设计方法对BG-11培养基进行了优化，结果表明适合于转基因聚球藻7942光自养培养的培养基需用7.36叭NaHCO。取代BG-11培养基中的0.02叭Na2C03，同时将K2HPO4.3H20

3、的浓度由BG-11培养基中的39mg/L提高至69.8mg/L。摇瓶培养和1.5L气升式光生物反应器培养表明，优化后培养基中藻细胞浓度分别为BG-11培养基中的1.98倍和1.49倍，而Tal表达能力分别比BG-11培养基中提高了90%和51%01.5L气升式光生物反应器中，研究了通入含不同浓度CO:的空气对藻细胞生长表达的影响。与通入空气相比，通入含5%CO:的空气对藻细胞生长影响不显著，但会减少藻细胞对N03’的吸收，同时降低可溶性蛋白及叶绿素a、类胡萝卜素和藻蓝蛋白的含量，且使藻细胞内的Tal含量降低。建立

4、了转基因聚球藻7942培养过程的光传递模型，并就光传递对藻细胞生长和Tal表达的影响进行了深入的分析。入射光强为9klx时1.5L气升式光生物反应器中藻细胞的表观最大光能得率口篇)和表观光能维持系数(mapp)分别为8.01x10"3g/kJ,0.68kJ/(gh)。光生物反应器中转基因聚球藻7942诱导实验表明，采用1.2L平板式光生物反应器和3k{·红光诱导可在光生物反应器中实现Ta，的表达。丫入光化学量子得率((pp)的概念，获得了转基因聚球藻7942光自养生长的本征动力学参数Yn二和m，其值分别为1.21

5、x10"g/ki和0.49kJ/(g-h)，且与代谢流分析得出的结果一致。因此较好地解决了迄今文献中所报道的微藻光自养生长的Y-和m随培养时的入射光强变化而改变这一问题。在分批培养过程光传递和动力学分析基础上，建立并优化了转基因聚球藻7942光生物反应器高密度高表达培养工艺。将在1.5L气升式光生物反应器中培养8d的转基第11页华东理工大学博士学位论文因聚球藻7942转入1.2L平板式光生物反应器中进行诱导表达，Tal表达量为4.52mg/L,藻细胞和Tai的生产速率明显优于摇瓶培养;与相同入射光强下1.5L气升

6、式光生物反应器培养相比，1.2L平板式光生物反应器培养能明显提高藻细胞和Tal的生产速率:9klx光照条件下1.5L气升式光生物反应器中转基因聚球藻7942半连续培养表明，更新速率为培养液体积的60%和70%时，藻细胞和Tal生产速率最大，分别为。.51则和1.81mg/d，是相同条件下1.5L气升式光生物反应器中转基因聚球藻7942分批培养的2.4手倍和3.20倍，是以BG-11为培养基时250ml摇瓶中培养的7.85倍和12.38倍。一梦谢流分析结果表明，转基因聚球藻7942生长过程以ATP为基准的细胞最大得

7、率Y,;为5.95g/mol,ATP维持系数MATP为0.78mmol/(g.h);藻细胞生长不仅受到光能供应的限制，而且还受到细胞本身光能转化效率低的制约，这表明提高藻细胞生产速率应从高光能供应效率的光生物反应器设计和藻种选育、基因工程改良两方面着手。藻细胞生长与Tal一泛素融合蛋白表达过程中氨基酸代谢流量存在明显差异，外源蛋白表达对藻细胞生长会产生较大冲击，从而影响到夕Fjp基因表达，因此应将培养过程和产物诱导合成过程分开以提高外源蛋白的产量o气关键词:转基因聚球藻7942:人源胸腺素al;光自养培养:表达华

8、东理工大学博士学位论文第m页StudyonphotoautotrophiccultivationofthetransgenicSynechococcussp.PCC7942andhumanthymosinalexpressionABSTRACTInthepasttwodecades,geneticengineeringofthecyanobacteriaachievedg