红笛鲷非特异性细胞毒性细胞活性及其受体表达的研究

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1、广东海洋大学硕士学位论文红笛鲷非特异性细胞毒性细胞活性及其受体表达的研究姓名：周晴申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：简纪常201206红笛鲷非特异性细胞毒性细胞活性及其受体表达的研究摘要本论文以我国南方主要海水养殖鱼类之一——红笛鲷(Lutjanussanguineus)为研究对象，制备了兔抗红笛鲷非特异性细胞毒性细胞(NCC)受体NCCI冲．1融合蛋白的抗血清，初步建立了NCC的有效分离手段，探讨了NCC的活性以及抗血清对NCC活性的抑制作用，成功构建了真核表达载体PGBKT7-NCCRP，研究了NCCRP．1的基因表达。将表

2、达的NCCRP．1融合蛋白进行纯化并利用纯化后的融合蛋白按常规方法免疫新西兰纯种大白兔，制各了兔抗红笛鲷NCCRP．1融合蛋白的抗血清，ELISA测定其效价为1：32000。利用该抗血清进行免疫组织化学分析，发现NCCRP．1只在头肾、脾脏和胸腺的特定细胞中表达。为深入研究NCCRP．1抗血清对红笛鲷NCC活性的抑制作用，首先分离红笛鲷头肾中的NCC，选用NCC特异性的作用对象之一——人类细胞系K562为靶细胞，通过流式细胞仪检测了NCC杀伤K562的活性；并在效应细胞和靶细胞中加入一定量的兔抗红笛鲷NCCRP．1融合蛋白抗血清，分析了

3、抗血清对NCC活性的抑制作用。结果表明，用48％的Percoll细胞分离液，在400xg，30min的条件下分离出来的NCC效果最佳，流式细胞仪检测NCC占整个白细胞的比例约为(44．8+0．8)％。当效应细胞NCC和靶细胞K562以一定的比例混合后，流式细胞仪检测发现NCC具有很强的杀细胞活性，且这个活性并不随着两种细胞的比例变化而变化；当效应细胞和靶细胞比例为l：l并加入不同体积倍比稀释的抗血清时，所制备的兔抗红笛鲷NCCRP．1融合蛋白抗血清可抑制NCC的活性，其抑制率随着抗血清体积的变化而变化。利用PGBKT7质粒，成功构建了真

4、核表达载体PGBKT7-NCCI冲，为进一步研究NCCRP．1蛋白的功能奠定基础。应用Real．timePCR技术，研究脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)刺激红笛鲷后NCCRP．1在不同组织里的表达水平差异，结果发现，LPS刺激红笛鲷24h后NCCRP一1在红笛鲷头肾、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、脑、肌肉和肠组织中均有表达，其中头肾表达量最高，脾脏次之，然后依次是肝脏、脑、肌肉、胸腺和肠，心脏表达量最少。LPS、苯酚和CuS04刺激红笛鲷后，随着刺激时间的增长，NCCRP．1表达量在各组织达到峰值的时间不同。以头肾为模式

5、组织，RT-PCR的结果显示，红笛鲷NCCRP-l在LPS、苯酚和CuS04的刺激下的表达模式相似，随着时间的增加NCCRP．1表达量逐渐增加，分别在24h、9h和12h处达到最高，达到对照组表达量的52倍、30倍和24倍左右，接着开始下调。本文初步探讨了NCC的活性及其受体NCCRP．1在先天性免疫中的基本功能，I为红笛鲷疾病防治提供一定的理论依据，为进一步研究NCCRP．1蛋白的生物学特性奠定基础。关键词：红笛鲷，NCCRP．1，NCC，表达，荧光定量PCRIIStudyontheactivityofnonspecificcytot

6、oxiccellandexpressionofitsreceptorinRedSnapper,LutjanussangumeusAbstractRedSnapperLutjanussanguineus，whichisoneofthemostubiquitousspeciesculturedmarinefishinsouthofChina,wasstudiedinthepaper．RabbitantiserumagmnstfusionproteinofnonspecificcytotoxiccellreceptorNCCRP-lWaspr

7、epared，effectiveNCCisolationmethodWaspreliminarilyestablished，theactivityofNCCandinhibitoryactionofrabbitantiserumtotheactivitywerestudied，recombinantofeukaryoticexpressionvectorPGBl0T7-NCCltPwassuccessfullyconstructed，andgeneexpressionofNCCRP．1Wasstudied．Thefusionprotei

8、nofNCCRP-1Waspurified，andtheanti·NCCRP—lserumwasobtainedbyimmuningNewZealandpedigreewhiterabbitswiththe