红笛鲷traf3基因的克隆、表达及功能研究

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1、分类号：Q786密级：公开UDC：577学号：2111201133/i海烊太嗲硕士学位论文红笛鲷TRAF3基因的克隆、表达及功能研究夏洪丽、'論指导教师：鲁义善教授串请学位类别：农学硕士专业名称：水产养殖研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制学院名称：水产学院中国•湛江2015年6月学位论文答辩委员会组成主席：委员：导师：时间：2015年6月4日广东海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经

2、发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：2015年6月4日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密□

3、。√（请在以上相应方框内打“√”）作者签名：2015年6月4日导师签名：2015年6月4日红笛鲷TRAF3基因的克隆、表达及功能研究摘要红笛鲷是我国南方重要的海水经济养殖鱼类之一，近年来多种疾病的发生，对红笛鲷养殖业造成了巨大的危害，目前对于病原感染时红笛鲷的免疫机制及其免疫信号的转导过程还缺少深入的了解。TRAFs是在多个物种中都高度保守的一类信号接头蛋白，能够介导多种生物学效应。其中TRAF3是最具多样化的成员之一，能够与胞内多种受体如TNFR、NLR、TLR/IL-1R等相互作用，进而介导多条免疫信号通路的转导

4、，因此TRAF3在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和免疫反应等多种生理过程中都有重要作用。为了研究TRAF3在红笛鲷免疫信号通路中的功能，本研究对红笛鲷TRAF3进行了克隆及功能分析，取得了以下研究成果：1.利用RACE技术获得了红笛鲷TRAF3（Ls-TRAF3)基因全长，生物信息学分析表明，Ls-TRAF3序列的5’非编码区（5’-UTR）为253bp，3’非编码区（3’-UTR）为1119bp，完整开放阅读框（ORF）为1788bp，可以编码595个氨基酸，蛋白预测分子量（MW）为67.44KDa，理论等电点（pI

5、）为7.5。经蛋白结构域分析发现Ls-TRAF3含有1个环指结构，2个锌指结构，coiled-coil和该家族保守的MATH结构域。同源性搜索结果显示Ls-TRAF3与斑马宫丽鱼、尼罗罗非鱼、柏氏朴丽鱼和虹鳟的同源性较高，分别为92%、91%、91%以及79%，系统进化分析显示：红笛鲷TRAF3与红鳍东方鲀（Takifugurubripes)的亲缘关系较近。2.Ls-TRAF3在红笛鲷各组织中广泛分布，且在脾、头肾和肝脏中的表达量相对较高。LPS和polyI:C刺激后，红笛鲷头肾淋巴细胞中Ls-TRAF3的表达显著上

6、调，且Ls-IL-6在LPS刺激后的表达变化趋势与TRAF3的表达呈负相关，而polyI:C孵育后，Ls-IRF3、Ls-Mx的表达与Ls-TRAF3的表达则呈正相关，表明Ls-TRAF3参与了宿主抗病免疫效应，并且在不同免疫信号通路可能发挥着不同的作用。酵母双杂交结果表明Ls-TRAF3和Ls-CD40的胞内段存在相互作用，且进一步的荧光素酶报告基因实验结果显示，过表达Ls-TRAF3能显著抑制NF-κB活性，且Zincfinger1、Zincfinger2和coiled-coil结构域缺失后，依然能够显著抑制NF

7、-κB活性，而RING和MATH缺失后，该抑制作用则明显减弱，表明RING和MATH结构域是Ls-TRAF3行使功能的关键结构域。以上结果表明，Ls-TRAF3在红笛鲷抗病免疫信号通路中发挥了重要作用。本研究为揭示鱼类TRAF3的功能奠定了基础，也为进一步了解鱼类免疫信号通路提供了新的方向。关键词：红笛鲷；TRAF3；基因克隆；免疫应答；酵母双杂交；NF-κB报告基因ICloning,ExpressionandFunctionalAnalysisofTRAF3inhumpheadsnapper,Lutjanussan

8、guineusAbstractHumpheadsnapper(Lutjanussanguineus)isoneofthemostimportantmarinefishinthesouthcoastalregionsofChina.Inrecentyears,theoutbreaksofseriousinfectiousdiseaseshavec