红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化.pdf

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1、第32卷第1期2012年2月广东海洋大学学报JournalofGuangdongOceanUniversity、，01．32N0．1Feb．2012红笛鲷重组激活基因ra91原核表达条件的优化及纯化张雪利，鲁义善，谢吉国，简纪常，吴灶和(广东海洋大学水产学院．广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制系点实验室．广东．湛江524025)摘要：克隆编码红笛鲷(￡“和nussanguineus)RAGI蛋白(recombinationactivatingproteinl)活性核心区的基因序列，并与pET．28a

2、(+)载体连接，构建原核表达载体pET．28a．RAGI，将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率，运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS．PAGE分析表明．在37℃条件下，利用0．1mmol／LIPTG诱导8h后，RAGl重组融合蛋白的表达量最大，相对分子质量与预测值相符，该蛋白主要以包涵体形式高效表达，利用HisTrapHP亲和柱使其得到进一步纯化；Westernblot分析显示，该融合蛋白可与鼠抗His．tag单克隆抗体发生特异性结合，说明表达蛋白为目的蛋白。关键词：红笛鲷；ragi基因

3、；原核表达；表达条件；优化；纯化；Westernblot分析中图分类号：$942．1+Q344+．13文献标志码：A文章编号：1673—9159(2012)Ol一001l—06PurificationandOptimizationofProkaryoticExpressionofraglGeneinRedSnapper(Lutjanussanguineus)ZHANGXue—li，LUYi—shan，XIEJi—guo，JIANJi—chang，WUZao—he(FisheriesCollegeofGuangdongOceanUniversity，

4、GuangdongProvincialKeyLaboratoryofPathogen纪BiologyandEpidemiologyforAquaticEconomicAnimals＆KeyLaboratoryofDiseasesControllingfo，．AquaticEconomicAnimalsofGuangdongHigherEducationInstitutions，Zhanjiang524025，China)Abstract：Inthecoredomain，thegenesequenceofcodingtheLutjanussangui

5、neusRAGlproteinwasclonedandtheninsertedintothepET-28“+)vectortoconstructprokaryoticexpressionplasmidpET-28a-RAG1．TherecombinantRAGlfusionproteinwasoverexpressedinEscherichh7coliBL2l(DE3)cellsinthepresenceofisopropyl-p·thiogalactopyranoside(IPTG)．Toachieveahighlevelexpression，t

6、heoptimizedinductionconditionwasidentifiedbyusingclassicalexperimentalmethod．SDS．PAGEanalysisshowedthatinducingthecellsat37℃in0．1mmol／LofIPTGfor8hourswastheoptimalconditionsforexpressionoftherecombinantRAGlfusionprotein．Therelativemolecularmassoftheexpressedproductwasidentical

7、totheexpectedproteinwhichWasmainlydetectedintheinsolublefractionofEcolieelllysates．TherecombinantRAGlfusionproteinWaspurifiedbyusingHisTrapHPaffinitycolumn．WesternblotanalysisshowedthattherecombinantRAGlfusionproteincouldbecombinedwithmouseanti-His—TagMab，SOtheexpressedprotein

8、wasdefinitelyconfirmedtotheaimprotein．Keywords：Lutjanussangui