CASK基因在胰岛β细胞特异性敲除小鼠的研究及其调控机制

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1、学校代码：10286分类号：R587密级：公开UDC：616学号：152970CASK基因在胰岛β细胞特异性敲除小鼠的研究及其调控机制研究生姓名：谢金阳导师姓名：王尧申请学位类别医学硕士学位授予单位东南大学一级学科名称临床医学论文答辩日期2018年5月30日二级学科名称内科学（内分泌）学位授予日期2018年6月20日答辩委员会主席马建华教授评阅人韩晓教授姚红红教授2018年6月4日硕士学位论文CASK基因在胰岛β细胞特异性敲除小鼠的研究及其调控机制专业名称：内科学研究生姓名：谢金阳导师姓名：王尧Identificationandpheno

2、typeanalysisondisruptionofCASKgeneinmousepancreaticβcellsandtheregulationonCASKAThesisSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofMedicalScienceSchoolofMedicineSoutheastUniversityMay2018东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注

3、和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。／ｆ－：ｔ！研究生签名．曰期：｝ｏ（ｈｆｐ东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司、万方数据电子出版社、北京万方数据股份有限公司有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文

4、档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布（包括以电子信息形式刊登）论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布（包括以电子信息形式刊登）授权东南大学研究生院办理。“■研究生签名：食％师签名：日期：＞／￥／部ｆ中文摘要CASK基因在胰岛β细胞特异性敲除小鼠的研究及其调控机制东南大学医学院摘要第一章胰腺β细胞CASK基因特异性敲除小鼠制作鉴定及表型分析目的：糖尿病是一类以血糖升高为特征的代谢性疾病，由于胰岛素分泌绝对或相对不足导致血糖升高，进而诱发糖尿病。钙/钙调蛋白

5、依赖性丝氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependentserineproteinkinase，CASK）在参与细胞内外信号传递、基因转录调控、神经递质释放、离子通道的调节和突触的信号传递等功能中发挥重要作用。我们前期的细胞学研究结果显示，CASK参与了胰岛素囊泡的锚定环节。为了在小鼠水平研究CASK基因缺失对胰岛素囊泡转运的影响，本实验拟建立胰岛β细胞CASK基因特异性敲除的小鼠动物模型，初步完成鉴定及表型分析。方法：1.利用条件性基因打靶和染色体位点特异性重组酶Dre-Rox系统，借助于同源重组将两个同向的lox

6、P位点置于CASK基因的编码重要功能域外显子6loxP/-loxP/Y两侧的内含子序列中，从而获得表型正常的CASK小鼠。2.利用CASK小鼠与MIP-Cre/ERT小鼠杂交后，tamoxifen诱导Cre酶进入细胞核剪切loxP位点之间基因序列，得到胰岛β细胞CASK特异性敲除小鼠。3.免疫荧光验证CASK基因敲除效率。4.利用免疫荧光观察胰岛大小及胰岛内α细胞和β细胞分布。loxP/-结果：1、SouthernBlot显示CASK小鼠基因标记位置正确；2、免疫荧光显示，CASK在胰腺各种细胞中均有表达，敲除小鼠胰岛β细胞中CASK的蛋

7、白表达下降；3、特异性敲除小鼠胰岛β细胞CASK对胰岛内α细胞和β细胞分布无明显差异。结论：成功制备胰岛β细胞特异性CASK基因敲除小鼠，尚未发现明显表型的异常。关键词：CASK；条件性敲除；胰岛素分泌；胰岛β细胞第二章转录因子PPARγ对CASK的转录调控作用目的：探讨转录因子PPARγ对CASK的转录调控作用。方法：用不同浓度罗格列酮处理胰岛β细胞系INS-1细胞观察胰岛素分泌的变化；用不同浓度及不同时间罗格列酮处理INS-1细胞，利用定量PCR、westernblot、免疫荧光检测CASK的表达变化；染色质免疫共沉淀寻找转录因子PP

8、ARγ在CASK启动子区域结合位点；利用PPARγ特异性干扰片段预处理INS-1细胞后观察罗格列酮对CASK的影响；观察干扰CASK后对罗格列酮刺激的胰岛素分泌有无影响。I东南大学硕士学位论文