血管内皮细胞特异性mir-21敲除对小鼠主动脉重建的影响及其机制初探

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1、申请上海交通大学博士学位论文血管内皮细胞特异性miR-21敲除对小鼠主动脉重建的影响及其机制初探博士生：张星漪学号：0090809061指导教师：姜宗来教授学科专业：生物学研究方向：血管力学生物学院系：生命科学技术学院国家自然科学基金资助项目Nos.11232010,11172176,30970703上海交通大学二〇一三年十一月万方数据DissertationforPhDDegreeofShanghaiJiaoTongUniversityAPRELIMINARYSTUDYONEFFECTSAND

2、MECHANISMSOFTHORACICAORTICREMODELINGINDUCEDBYENDOTHELIAL-SPECIFICDELETIONOFMIR-21INMICEPhDCandidate:XingyiZhangSupervisor:ProfessorZonglaiJiangDepartment:BiologySchool:LifeSciencesandBiotechnologyShanghaiJiaoTongUniversityNovember2013万方数据上海交通大学博士学位论文

3、血管内皮细胞特异性miR-21敲除对小鼠主动脉重建的影响及其机制初探摘要血管重建（remodeling）指机体在生长及发育、衰老和疾病过程中，血管为适应体内外环境变化而发生的形态结构和功能改变。血管形态结构重建描述了血管的结构变化，而功能重建则描述了血管舒张功能和血管力学性质等变化。血管重建是心血管疾病的基本和共同的病理学基础，其机制探讨对于心血管疾病的防治具有重要意义。由于血管重建的体内外影响因素众多，以至于其机制迄今尚未完全阐明。近年来，microRNAs（miRs）在血管重建中的调控作用越

4、来越受到人们的关注,其中miR-21在心血管生物学及疾病方面的研究成为热点。血管内皮细胞（endothelialcells，ECs）miR-21功能的离体研究已有许多报道。然而，在体ECs的miR-21对心血管的作用尚缺少研究。本研究拟构建ECs的miR-21特异敲除小鼠模型，探讨在体情况下ECs的miR-21在血管重建中的作用及其机制，旨在为血管重建机制以及临床相关疾病研究提供一些理论和实验依据。本文采用Cre/LoxP和FLP/FRT系统构建ECs的miR-21特异敲除小鼠模型，并用原位杂交

5、（insituhybridization,ISH）、PCR、荧光定量PCR和半定量RT-PCR的方法在DNA和RNA水平上明确是否敲除了ECs的miR-21。然后，应用组织学染色方法分析血管壁几何形态学和组织结构成分；荧光定量PCR、Westernblot法、Fastin法I万方数据上海交通大学博士学位论文和Sircol法检测血管弹性蛋白和胶原蛋白的表达变化，确定血管形态结构重建。测量小鼠尾动脉血压、动脉张开角、顺应性、血管条最大张力和内皮依赖性舒张反应，确定血管功能重建。最后，用Western

6、blot法检测miR-21的靶蛋白—Smads家族蛋白和PTEN等的表达，初步探讨了ECs的miR-21影响血管重建的机制。结果显示，①ISH、荧光定量PCR和半定量RT-PCR方法确定小鼠胸主动脉ECs的miR-21在RNA水平基本被删除，PCR方法确定ECs的miR-21在DNA水平基本被删除，但是主动脉组织还存在miR-21；②ECs的miR-21特异敲除小鼠胸主动脉中膜明显增厚、内径显著变小，而壁厚/内径比显著增加；弹性纤维面积比显著下降，而胶原纤维面积比无显著性差异；③ECs的miR-

7、21特异敲除小鼠胸主动脉表达的弹性蛋白、I型胶原和III型胶原在mRNA和蛋白水平表达均显著下降；Fastin法和Sircol法检测结果也显示，胸主动脉弹性蛋白和胶原蛋白含量减少；④ECs的miR-21特异敲除小鼠的舒张压显著降低、胸主动脉的张开角增加以及顺应性曲线下移；胸主动脉血管条去甲肾上腺素诱导的收缩反应所产生的最大张力显著下降，ACh诱导的内皮依赖性血管舒张反应能力降低；⑤ECs的miR-21特异敲除小鼠血管组织的Smad7表达上升，Smad2/5表达下降，CTGF表达上升，下游的MMP

8、-2和MMP-10表达上升，而TIMP-4表达下降，PTEN表达无显著性差异；⑥ECs的miR-21特异敲除小鼠胸主动脉培养ECs的Smad7表达上升，Smad2/5表达下降，CTGF表达下降，p-Smad5水平升高，PTEN表达上升，p-PTEN水平降低。结果表明，本研究成功构建的ECs的miR-21特异敲除小鼠具有在体研究内皮细胞miR-21生理功能的科学价值。ECs的miR-21敲II万方数据上海交通大学博士学位论文除导致胸主动脉发生形态结构和功能重建，主要表现为动脉中膜增厚、壁厚/内径比