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1、miR-21论文：MIR-21在低血流诱导的小鼠血管重建中的作用及其机制【中文摘要】血管重建(remodeling)是指机体在生长、发育、衰老和疾病过程中,血管为适应体内外环境的变化而发生的形态结构和功能的改变。低切应力诱导血管发生病理性重建,从而导致动脉粥样硬化和血管再狭窄等心血管疾病。在低切应力诱导血管重建过程中,microRNA是否起到调控作用,其作用机制如何,尚需进一步探讨。因此,研究低切应力条件下血管细胞的microRNA表达和调控机制,对于阐明心血管疾病的发生发展机制以及寻找可能的防治靶标具有重要的理论和实际意义。本研究通过Cre-Loxp基因敲除系统,
2、构建了SM-CreERT2(ki)miR-21Loxp纯合小鼠;Tamoxifen诱导Cre酶表达条件性敲除平滑肌细胞Loxp位点间的基因片段;结扎颈外和颈内动脉构建小鼠颈总动脉低血流模型;Real-TimePCR检测小鼠颈总动脉miR-21的表达变化;小鼠颈总动脉HE染色血管组织切片测量血管几何形态学变化;RT-PCR检测TGF-β1刺激培养的VSMCsmiR-21的表达;应用miR-21inhibitors和mimics转染培养的VSMCs,使miR-21被抑制或过表达;Transwell实验检测VSMCs迁移,CCK-8检测VSMCs增殖,AnnexinV检测
3、VSMCs凋亡。Westernblotting检测转染后的VSMCs的PTEN、Bcl-2蛋白的表达。最后,通过构建报告基因质粒来验证miR-21与靶位点mRNA间的关系。结果显示:①Tamoxifen诱导了VSMCs的Cre酶的特异性表达;Cre酶表达条件性敲除VSMCsLoxp序列中的miR-21;②低血流引起的低切应力可以诱导小鼠颈总动脉内膜新生,血管壁厚/内径比和内膜/中膜面积比均显著增高,miR-21表达显著上升;③VSMCs特异miR-21的基因敲除小鼠内膜新生显著降低,血管壁厚/内径比和内膜/中膜面积比相应减小;④TGF-β1诱导可使VSMCs的miR
4、-21表达上升;在miR-21inhibitor干扰下VSMCs的PTEN和Bcl-2蛋白表达增加,细胞迁移和增殖受到抑制;在miR-21mimics干扰下VSMCs的PTEN和Bcl-2蛋白表达下降,细胞迁移增加;⑤将Bcl-2与miR-21相互作用的cDNA片段整合到带有GFP基因的质粒上,对其进行miR-21siRNA干扰后,发现GFP亮度发生变化,验证了Bcl-2是miR-21的靶目标。上述在体和离体实验结果表明,平滑肌细胞特异条件性miR-21基因敲除小鼠构建成功;低血流(低切应力)诱导血管组织miR-21的表达上调,动脉内膜新生;平滑肌细胞条件性敲除mi
5、R-21明显抑制了低血流诱导的血管新生内膜的形成;miR-21通过调节VSMCs的PTEN及Bcl-2的表达,进而影响VSMCs的增殖、迁移与凋亡,参与血管重建的调控。【英文摘要】Vascularremodelingdefinesasaprogressinwhichthevesselmorphologyandfunctionaccommodatetheenvironmentduringtheperiodofgrowth,development,aginganddiseases.Normalshearstressmaintainsvascularhomeostasis
6、whilethepathologicalvascularremodelingwouldoccurunderlowshearstress(LowSS),whichcouldinduceatherosclerosisandrestenosis.Inthisprocess,ThefunctionandmechanismofmicroRNAsisnotclear.Therefore,itisveryimportanttoelucidateexpressionandregulationmechanismofmicroRNAsinvascularremodelinginduce
7、dbyLowSSforprevention,diagnosisandtreatmentofcardiovasculardiseases.Inthepresentstudy,SM-CreERT2(ki)miR-21Loxp+/+transgenicmicewasestablished;Cre-LoxpgeneknockoutsystemwasusedtoknockoutmiR-21inVSMCsaftertamoxifentreatment;Lowbloodflowmousemodelwasestablishedbyligatingleftexternalandi
