抗lag-3抗体对脓毒症小鼠保护作用及免疫功能影响的研究

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1、第二军医大学博士学位论文抗LAG--3抗体对脓毒症小鼠保护作用及免疫功能影响的研究姓名：娄景盛申请学位级别：博士专业：麻醉学指导教师：邓小明201205抗LAG．3抗体对脓毒症小鼠保护作用及免疫功能影响的研究摘要目的脓毒症(sepsis)是指由于创伤、感染等一系列因素引起机体过激的炎症反应和免疫应答，继而对机体产生严重危害的疾病，其病死率一直居高不下。脓毒症病理生理过程中免疫系统的功能抑制是其中的一个非常突出问题，并已经成为脓毒症病死率居高不下以及各种治疗效果不佳的重要原因。而在导致免疫抑制的各种原因中，淋巴细胞的凋亡以及功能障碍

2、是一个重要的原因，但是其具体发生机制目前尚未完全清楚。淋巴细胞活化基因．3分子(1ymphocyteactivationgene3，LAG一3，CD223)是免疫球蛋白超家族的一员，可负性调节免疫细胞的各项功能和生存周期。已有研究表明，LAG．3在病毒感染、自身免疫疾病以及肿瘤所致的免疫系统功能紊乱中发挥着重要作用，通过影响LAG．3的功能可以改善这些疾病演进过程中免疫功能失常状态，从而改善疾病的预后。LAG．3分子在脓毒症免疫抑制中扮演何种作用，干预LAG．3分子能否影响脓毒症的预后和免疫系统功能尚未见报道。为此，本实验旨在研究

3、盲肠结扎穿孔(cecalligationandpuncture，CLP)脓毒症后LAG．3分子在小鼠不同免疫细胞上的表达变化；并探索应用抗LAG-3抗体治疗后，是否对脓毒症小鼠产生保护作用，是否会影响淋巴细胞凋亡及功能，并以此探求其在脓毒症免疫抑制中的作用，以及脓毒症免疫治疗合理可靠的治疗靶点。方法l、采用CLP术致脓毒症小鼠模型。将24只C57B啪小鼠随机分为假手术组(n=10)和CLP组(n_14)，手术24h后流式细胞仪检测CLP组和假手术组小鼠外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CDl9+B淋巴细胞、自然杀伤(n

4、aturalkiller,NK)细胞、脾脏CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(regulatoryTcells，Treg)、树突状细胞(dendriticcell。DC)上的LAG．3表达水平。2、将81只C57BL／6小鼠随机分为假手术组(Sham,n=9)、CLP组(CLP，n=16)、CI。P+腹腔注射抗LAG．3抗体组(i．p．Anti．LAG．3，n=16)、CLP+腹腔注射同型对照抗体组(i．P．Isotype，n=12)、CLP+尾静脉注射抗LAG-3抗体组(i．v．Anti．LAG．3，第二军医大学博士学位论文n=

5、16)和CLP+尾静脉注射同型对照抗体组(i．v．Isotype，n=12)，手术后3h给予抗LAG一3抗体或同型对照抗体(均每只so鹇／200p1)，观察抗体干预后小鼠10d生存率及生存时间。3、将55只C57BL／6小鼠随机分为假手术组(Sham，n．7)、CLP组(CLP,n=18)、抗LAG一3抗体组(Anti．LAG一3，n=18)、同型对照抗体组(Isotype，n=12)，除假手术组外其余小鼠均行CLP术，并于手术后3h按分组分别经腹腔给予抗LAG-3抗体或同型对照抗体(均每只50岭／200山)。24h后取各组小鼠肺

6、组织、外周血及腹腔冲洗液，检测肺组织湿重／干重比值，血液及腹腔冲洗液细菌负荷，以及血浆TNF．a、IL．6和IL．10水平。4、将33只C57BL／6小鼠随机分为假手术组(Sham,n=8)、CLP组(CLP,n--9)、抗LAG一3抗体组(Anti—LAG-3，n=9)、同型对照抗体组(Isotype，n=7)，除假手术组外其余小鼠均行CLP术，并于手术后3h按分组分别经腹腔给予抗LAG．3抗体或同型对照抗体(均每只50飕／20091)。24h后取各组小鼠外周血、脾脏及胸腺，采用流式细胞仪检测各组小鼠外周血及脾脏CD4+、CD8

7、+T淋巴细胞细胞计数，同时检测小鼠胸腺T淋巴细胞凋亡情况。另取同样分组及同样处理的18只C57BL／6小鼠脾脏及胸腺，采用TUNEL法检测其凋亡情况。5、取CLP术后18h小鼠脾脏，采用密度梯度法分离小鼠脾脏淋巴细胞，之后将分离得到的细胞分为两部分，每部分设立对照组(Contr01)、抗LAG．3抗体组(Anti．LAG．3)和同型对照抗体组(Isotype)。一部分以抗CD3／抗CD28抗体培养诱导细胞凋亡，72h后收集细胞检测；另一部分用重组小鼠TNF—a培养诱导细胞凋亡，18h后收集细胞检测。均采用流式细胞仪检测各组CD4+

8、T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的凋亡情况。6、取CLP术后18h小鼠脾脏，采用密度梯度法分离小鼠脾脏淋巴细胞，之后将分离得到的细胞分为对照组(Contr01)、抗LAG．3抗体组(Anti．LAG．3)和同型对照抗体组(Isotype)，先以抗CD