hiv-1 ma蛋白的表达纯化及免疫原性的初步研究

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1、南开大学硕士学位论文HIV--1MA蛋白的表达纯化及免疫原性的初步研究姓名：王娜申请学位级别：硕士专业：药物化学指导教师：张耀洲2012-05!兰塑至．一——__——————————————————————————————一。中文摘要HIV-1基质蛋白在病毒的组装、出芽等方面起重要的作用。而且比较保守，变异发生率低，而且是细胞免疫应答的靶抗原，能够产生较好的免疫效果。本研究以保藏菌株质粒pNL4．3为模板，在引物设计时加入TAA终止密码子，通过聚合酶链式反应扩增获得艾滋病病毒MA蛋白编码序列，含

2、有399bp，编码132个氨基酸残基，蛋白质分子量大约为17kD，等电点为9．27。把带有相应酶切位点的MA编码序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)qb，构建了重组表达载体pET-28a．ma，经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒正确。将该重组质粒转化E．coBBL21(DE3)，37℃时经IPTG诱导后，将菌体裂解，作聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，与阴性对照实验相比在20kD附近有一条特异性蛋白质条带，MA蛋白17kD融合载体His标签3．56kD，说明目的蛋白MA成功表达，大

3、小与预测结果相符。表达的融合蛋白是可溶的，菌体裂解后存在于上清中。利用金属镍亲和层析的方法初纯化蛋白。再经过凝胶过滤层析，离子交换层析纯化后可以获得较纯的蛋白质，经过MALDI．TOFMS鉴定其为带有His标签的MA蛋白。将纯化后的融合蛋白与免疫佐剂混合后，分四次免疫新西兰雄兔，获得特异性较强的多克隆抗体，并利用原核表达的融合蛋白制备抗原亲和层析柱对抗体进行纯化。获得纯度及特异性较好的抗体，用于目的蛋白MA真核表达的鉴定纯化。在真核方面，把带有相应酶切位点的MA编码序列克隆到供体质粒pFastB

4、acl中，并且鉴定重组成功；用供体质粒pFastBacl．ma转化DHl0Bac，通过蓝白斑筛选获得重组的Bacmid-ma，利用PCR的方法和测序鉴定，说明重组成功。提取重组的Bacmid．ma基因组，用其转染家蚕卵巢上皮细胞，待细胞发病后；经过PCR鉴定，获得重组有MA编码序列的杆状病毒。发病细胞经过传代后，用自制的兔多克隆抗体为一抗，Westernblotting鉴定目的蛋白MA在杆状病毒表达系统中成功表达，并且不带有任何标签。用重组的杆状病毒感染家蚕五龄幼虫以及蚕蛹，利用Westernb

5、lotting也检测到了目的蛋白MA的表达。利用纯化的多克隆抗体制备抗体亲和层析柱，对真核表达的目的蛋白进行纯化，经过质谱鉴定，确定其为MA蛋白。中文摘要用原核表达的MA蛋白与正常的蚕蛹粉提取物混合和真核表达的MA蛋白的蚕蛹粉提取物，对小鼠进行口服免疫研究，初步探索利用杆状病毒系统表达的MA蛋白的口服免疫原性。关键词：MA蛋白，杆状病毒，免疫原性AbstractTheHIV-1matrixprotein(MA)playsaveryimportantroleinseveralstagesofthe

6、lifecycleofHIV-1，includingvirusassemblyandbudding．TheMAisveryconservativeSOitisagoodantigen．Inthisstudy,plasmidpNL4—3，whichcontainsgenomeofHIV-1，wasusedastemplateofPCR．TheORFofproteinMAwasobtainedbyadding磁么asendingcodon．ProteinMA，contains132aminoacid

7、residueswithmolecularweightof17kDandisoelectricpointof9．27．ThecodingsequenceofMAwasclonedintotheE．coliexpressionvectorpET-28a(+)．TherecombinantplasmidpET-28a(+)。mawasthentransformedintoE．coliBL21(DE3)andtheexpressionoffusionproteinHis．MAwasinducedbyI

8、PTGatthetemperatureof37℃．whichexsitedinsupernatant．AfterpurificationwithNi计affinitychromatograpHyandFPLC，thefusionproteinwasmixedwithimmuneadjuvantasanantigentoimmunerabbit，bywhichtheantibodywasprepared．Thetiterofthepolyclonalantibodyreached1：25600de