欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:33706664
大小:10.94 MB
页数:66页
时间:2019-02-28
《hiv-1 ma蛋白的表达纯化及免疫原性的初步研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、南开大学硕士学位论文HIV--1MA蛋白的表达纯化及免疫原性的初步研究姓名:王娜申请学位级别:硕士专业:药物化学指导教师:张耀洲2012-05!兰塑至.一——__——————————————————————————————一。中文摘要HIV-1基质蛋白在病毒的组装、出芽等方面起重要的作用。而且比较保守,变异发生率低,而且是细胞免疫应答的靶抗原,能够产生较好的免疫效果。本研究以保藏菌株质粒pNL4.3为模板,在引物设计时加入TAA终止密码子,通过聚合酶链式反应扩增获得艾滋病病毒MA蛋白编码序列,含
2、有399bp,编码132个氨基酸残基,蛋白质分子量大约为17kD,等电点为9.27。把带有相应酶切位点的MA编码序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)qb,构建了重组表达载体pET-28a.ma,经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒正确。将该重组质粒转化E.coBBL21(DE3),37℃时经IPTG诱导后,将菌体裂解,作聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,与阴性对照实验相比在20kD附近有一条特异性蛋白质条带,MA蛋白17kD融合载体His标签3.56kD,说明目的蛋白MA成功表达,大
3、小与预测结果相符。表达的融合蛋白是可溶的,菌体裂解后存在于上清中。利用金属镍亲和层析的方法初纯化蛋白。再经过凝胶过滤层析,离子交换层析纯化后可以获得较纯的蛋白质,经过MALDI.TOFMS鉴定其为带有His标签的MA蛋白。将纯化后的融合蛋白与免疫佐剂混合后,分四次免疫新西兰雄兔,获得特异性较强的多克隆抗体,并利用原核表达的融合蛋白制备抗原亲和层析柱对抗体进行纯化。获得纯度及特异性较好的抗体,用于目的蛋白MA真核表达的鉴定纯化。在真核方面,把带有相应酶切位点的MA编码序列克隆到供体质粒pFastB
4、acl中,并且鉴定重组成功;用供体质粒pFastBacl.ma转化DHl0Bac,通过蓝白斑筛选获得重组的Bacmid-ma,利用PCR的方法和测序鉴定,说明重组成功。提取重组的Bacmid.ma基因组,用其转染家蚕卵巢上皮细胞,待细胞发病后;经过PCR鉴定,获得重组有MA编码序列的杆状病毒。发病细胞经过传代后,用自制的兔多克隆抗体为一抗,Westernblotting鉴定目的蛋白MA在杆状病毒表达系统中成功表达,并且不带有任何标签。用重组的杆状病毒感染家蚕五龄幼虫以及蚕蛹,利用Westernb
5、lotting也检测到了目的蛋白MA的表达。利用纯化的多克隆抗体制备抗体亲和层析柱,对真核表达的目的蛋白进行纯化,经过质谱鉴定,确定其为MA蛋白。中文摘要用原核表达的MA蛋白与正常的蚕蛹粉提取物混合和真核表达的MA蛋白的蚕蛹粉提取物,对小鼠进行口服免疫研究,初步探索利用杆状病毒系统表达的MA蛋白的口服免疫原性。关键词:MA蛋白,杆状病毒,免疫原性AbstractTheHIV-1matrixprotein(MA)playsaveryimportantroleinseveralstagesofthe
6、lifecycleofHIV-1,includingvirusassemblyandbudding.TheMAisveryconservativeSOitisagoodantigen.Inthisstudy,plasmidpNL4—3,whichcontainsgenomeofHIV-1,wasusedastemplateofPCR.TheORFofproteinMAwasobtainedbyadding磁么asendingcodon.ProteinMA,contains132aminoacid
7、residueswithmolecularweightof17kDandisoelectricpointof9.27.ThecodingsequenceofMAwasclonedintotheE.coliexpressionvectorpET-28a(+).TherecombinantplasmidpET-28a(+)。mawasthentransformedintoE.coliBL21(DE3)andtheexpressionoffusionproteinHis.MAwasinducedbyI
8、PTGatthetemperatureof37℃.whichexsitedinsupernatant.AfterpurificationwithNi计affinitychromatograpHyandFPLC,thefusionproteinwasmixedwithimmuneadjuvantasanantigentoimmunerabbit,bywhichtheantibodywasprepared.Thetiterofthepolyclonalantibodyreached1:25600de
此文档下载收益归作者所有