hiv-1整合酶表达、纯化及反应特征的研究

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1、摘要HIV．1整合酶是由HIV．1病毒pol基因编码的分子量为32kDa的蛋白质，能够介导病毒DNA与宿主染色体的整合，是病毒复制周期中必不可少的环节，抑制整合酶能够有效阻止病毒在体内复制。同时，人体细胞中无整合酶的功能类似物，因此，整合酶是抗HIV．1的理想靶点。HIV-I整合酶在体内通过催化3’端加工和链转移两步反应，实现病毒DNA与宿主基因组的整合。整合酶通过特异性地识别病毒DNALTR的CAGT-3’序列，切除末端的GT二核苷，暴露出高度保守的CA．OH3’，病毒cDNA的3’端腺苷酸通过转脂反应以3'-OH同宿主DNA切口的5

2、7端的磷酸基团形成新的磷酸二酯键，实现共价结合。晶体结构研究显示：整合酶由三个结构域组成：l、N端结构域：包含锌指结构，能够促进整合酶的四聚化，影响C端区与病毒cDNA的结合；2、核心结构域：是整合酶发挥功能的关键区域，三个高度保守的酸性氨基酸残基：Asp64，Aspll6和Glul52为酶的活性中心，能够结合二价金属阳离子(M92+／Mn2+)，形成DD35E型结构：3、C端结构域：其主要功能是非特异性结合DNA，介导蛋白质分子内和分子间的相互作用。因为以前普遍采用的方法使用带有放射性标记的病毒DNA底物，和整合酶共育后，经过变性胶电

3、泳以及放射自显影，显示整合酶的反应产物。但这种实验具有耗时较长及放射线污染的缺点。为了克服以上缺点，本实验分别采用基于磁珠的酶联免疫吸附试验方法(enzyme．1inkedimmunosorbentassay,ELISA)及基于荧光的分子信标法鉴定整合酶3’端加工和链转移的反应活性，并研究其反应特性。根据计算机模拟结果，设计可能为整合酶关键残基的突变位点，以HIV-1B亚型国际标准株pol基因为模板克隆出整合酶基因，将其插入pET28a(+)原核表达载体。通过重叠PCR方法将第188位赖氨酸突变为谷氨酸(KI88E)，第l89位甘氨酸突

4、变为丝氨酸(GI89S)，构建了HIV-1整合酶突变体pET28a(+)／IN(K188E／G189S)，为后续研究病毒DNA．整合酶间相互作用打下实验基础。本论文的研究目的是：(1)用pET28a(+)IN(FI85K／C280S)表达载体在大肠杆菌中高效表达HIV-I整合酶：(2)采用亲和层析技术纯化HIV-1IN(F185K／C280S)蛋白质：(3)采用基于磁珠的酶联免疫吸附试验方法检验整合酶蛋白3’端加工和链转移反应活性：(4)利用基于荧光的分子信标法研究病毒DNA．整合酶问相互作用特性；(5)构建HIV-1整合酶突变体pET

5、28a(+)／1N(KI88E／GI89S)。本论文研究方法：包含HIV-1整合酶基因的重组质粒pET28a(+)IN(F185K／C280S)在。EocliBL21(DE3)中进行可溶性表达HIv-l烈(F185K／C280S)，通过镍柱纯化，获得高纯度及可溶的整合酶蛋白。我们采用基北京工业大学理学硕士学位论文于磁珠的酶联免疫吸附试验方法鉴定整合酶的3’端加工和链转移反应活性，利用基于荧光的分子信标法对病毒DNA．整合酶问相互作用进行反应特性分析。根据计算机模拟结果，对整合酶核心区域的第188位和第189位氨基酸残基进行突变实验，构建

6、HIV-I整合酶突变体pET28a(+)／IN(K188E／G189S)。本研究所获得结果：经过表达和纯化，我们得到了较纯的整合酶蛋白，在整合酶活性鉴定实验中，我们表达和纯化的整合酶蛋白表现出较好的生物学活性。根据计算机模拟结果，成功构建HIV-1整合酶突变体pET28a(+)／IN(KI88E／G189S)。关键词：人类免疫缺陷I型病毒；整合酶：ELISA；分子信标IIAbstractHIV一1integraseenzymeisa32kDaproteinencodedbyHIVpolgene．Itisresponsibleforint

7、egrationofviralcDNAintohostchromosomalDNA．whichiSindispensableforHIVreplication．TheinhibitionofintegraseactivityisaneffectivemeasuretopreventHIV-1replication．Moreover,integrasehasnoknownfunctionalanalogueinhumancells．Therefore，integrasebecomesanidealtargetforanti．HIVther

8、apy．TheHIV-1integrasepossessestwodifferentactivities：3'-processingandstrandtransfer．Atierbindingtothedo