hiv-1反转录酶表达、纯化、结晶和功能的研究

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1、摘要获得性免疫缺陷综合症即艾滋病(Acquriedimmunodeficiencysyndrome，AIDS)，是山人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)诱发引起的。HIV是一种逆转录病毒，分为HIV-I和HIV一2两种类型。HIV一1逆转录酶(reversetranscriptase，RT)在病毒生命周期中起重要作用。病毒进入宿主细胞胞之后，通过逆转录酶将单链RNA反转录为双链DNA，随后病毒DNA在整合酶的作用下，整合到宿主DNA中，完成转录、翻译等整个生

2、命周期。在HIV—l病毒的复制过程中，快速复制和易出错的特点使病毒在感染者体内可以快速地演化，导致HIV-I疫苗的研发和药物治疗具有很大的挑战性。到目前为止，抗HIv_l药物存临床治疗中已经取得很大的成功，延迟病人生命总时问超过三百万年。不幸的是，HIV-1可以对几乎所有的可使用的药物产生抗药性。虽然一些效果较好的抗HIV-I药物已经被认可并被用于临床治疗，但是，这些药物的细胞毒性和病毒的耐药性要求我们必须研发更有效药物。逆转录病毒复制过程中的三个关键酶：逆转录酶、整合酶和蛋白酶，都是很好的药物靶点

3、。两种不Ⅻ类型的逆转录酶抑制剂：核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂，都可以抑制逆转录酶的聚合酶活性，都被用于治疗HIV—l感染，同时还有一类比较有研究前景的化合物，它们可以抑制核酸水解酶(RNaseH)活性，或者通过其它方式抑制聚合酶活性。为了研究开发更有效的HIV一1逆转录酶抑制剂，我们设计了一系列的小分子抑制剂，包括NNRTIs和NRTIs，通过化学合成的方法，合成这些小分子抑制剂。jf：通过分二r生物学实验方法，构建HIV一1RT的表达载体，大量表达纯化出高纯度的RT蛋白，用于生物化

4、学实验和结品实验。通过一系列的生化实验，我们验证了所纯化的HIV-1RT蛋白与双链DNh、单链DNA和HIV一1整合酶(IN)的相互作用，以及HIV-1蛋白水解酶对HIV一1RT的P66亚基的有限水解活性。我们得到了HIV—IRT蛋白的晶体，经过一系列的优化，利用X一光衍射射线晶体学技术最终获得衍射能力达到2．1A的高分辨率的RT蛋向品体。但是抑制剂与RT的共结晶实验以失败告终，我们没有得到结合有我们所设计的抑制剂的复合物品体，但是我们的结晶实验为研究开发更有效的HIV一1的RT的抑制剂提供便利的研

5、究平台。T摘要关键词：人免疫缺陷病毒逆转录酶抑制剂X一光射线品体学IIAbstractABSTRACTHumanimmunodeficiencyvirustypeI(HIVo1)istheiducementforthe‘AcquiredImmunode行ciencySyndrome(AIDS)HIV-Iisaretroviruswhichencodesareversetranscriptase(RT)thatisrequiredforviralreplication．RTisresponsiblef

6、ortheconversionofthesingle·-strandedRNAviralgenomeintodouble·-strandedDNAthatsubscquentlyintegrasedintothehostDNAbyintegrase．TherapidreplicationofHIV-1andtheerrorsmadeduringviralreplicationcausethevirustoevolverapidlyinpatients，makingtheproblemsofvacci

7、nedevelopmentanddrugtherapyparticularlychallenging．Intheabsenceofaneffectivevaccine，drugsaretheonlyusefultreatment．Anti—HIVdrugswork，SOfardrugtherapyhassavedmorethanthreemillionyearsoflife．Unfortunately,HTV二1developsresistancetoalloftheavailabledrugs．A

8、lthoughanumberofusefulanti—HIVdrugshavebeenapprovedforuseinpatients，theproblemsassociatedwithdrugtoxicityandthedevelopmentofresistancemeansthatthesearchfornewdrugsisanongoingprocess．Thethreeviralenzymes，reversetranscriptase(RT)，integras