丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究-论文.pdf

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1、第39卷第7期中圈中药杂志V0J．A39．Issue72014年4月pril，2014丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究刘玉忠，申业，荣齐仙，吴文燕，李瑞博，吴志刚，陈敏(中国中医科学院中药资源中心，北京100700)[摘要]WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白，是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的SmWRKY1cDNA构建到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BI21(DE3)进行诱导表达，SDS—PAGE结果显示该蛋白的大小约36kDa，与预测的蛋白相对分子质量一样，说明该基因在大肠杆菌中成功表达。对影响蛋白表达的4个因素：

2、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化，结果表明在大肠杆菌BL21(DE3)中，当A达到约1．0～1．5时，加人0．2tool·L的IPTG，在2O℃诱导培养12h后SmWRKY1蛋白的表达量较高。原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在，采用尿素提取包涵体蛋白，用Nj“亲和色谱法纯化表达蛋白，纯化后蛋白的质量浓度为2．454g·L～。经蛋白质印迹检测，His—Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白，进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步开展SmWRKY1基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础

3、。[关键词]丹参；SmWRKY1；优化表达；包涵体蛋白；蛋白质印迹WRKY转录因子作为植物中最庞大的转录因进行诱导表达，并对其诱导条件进一步优化，采用尿子家族之一，在植物的生长发育过程中起到非常重素提取包涵体蛋白，利用His．Tag亲和色谱对该蛋要的作用，除参与植物对生物和非生物环境胁迫的白进行纯化，Western印迹进一步验证SmWRKY1在调控作用，还参与了次生代谢产物的生物合成的调大肠杆菌中表达。丹参SmWRKY1基因在大肠杆菌节作用。据报道该转录因子可以与目的靶基因启动中的成功表达及纯化，为研究该基因对丹参酮类等子区域的W．BOX顺式元件(C／T)TGAC(T／C)特异化合物

4、的生物合成的调节控制奠定了一定的基础。性结合_1，从而激活相关基因的表达，实现其在转1材料录水平上的调控作用。Xu和Wang等从亚洲木本1．1菌株、质粒、培养基棉花中分离得到GaWRKY1，能激活植物抗毒素棉籽转化菌株EscherichiacoliDH5a和表达宿主细酚生物合成过程中关键酶CAD1基因的表达，进一胞BI21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公步促进棉籽酚的生物合成_3J。Kato和Dubouzet等司，表达载体pET28a为本实验室所保存。E．coli发现日本黄连中WRKY1蛋白能够调节黄连生物合[pET28a-SmWRKY1]是转化了pET28a—SmWRKY1成

5、途径中下游基因的表达，促进日本黄连生物碱的的大肠杆菌；仅转化pET28a质粒的大肠杆菌E．CO．生物合成J。由此可见WRKY转录因子在转录水如[pET28a]为阴性对照重组菌。平上对次生代谢产物生物合成途径中的关键酶起着LB培养基(胰蛋白胨10g·L～，酵母提取物5非常重要的调节作用。g·L～，NaC110g·L一，pH7．0；固体培养基加琼本研究将已克隆的SmWRKY1cDNA构建到原脂糖15g·L)用来培养大肠杆菌。核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21(DE3)1．2抗生素卡那霉素购自Sigma公司，配置质量浓度[收稿日期]2013—12-19为50g·L～。[基金项目

6、]国家自然科学基金项目(81173490，81130070)1．3酶和试剂[通信作者]陈敏，研究员，主要从事中药鉴定与分子生药学研限制性核酸内切酶购自NEB公司；IPTG购自究，Tel：(010)64014411-2955，E—mail：cm315keke@163．conSigma公司；原核表达所用的非预染蛋白Marker购[作者简介]刘玉忠，硕士研究生，Tel：(010)64014411-2956，E—mail：zhong129shan921@163．corn自Fermentas公司；NiSepharose6FastFlow购自·1214·第39卷第7期V01．39．Issue7申

7、圈中药杂志2014年4月ChinadournIofCh。noseateriaedicaApril，2014GE公司；预染Marker购自NEB公司，His—Tag单克0．45m的滤膜过滤后，采用N亲和色谱法，用隆抗体，HRP一羊抗小鼠二抗及ECL超敏发光液购自Ni“SepharoseTM6FastFlow过柱纯化滤液，然后采用华兴博创公司。其他试剂均为分析纯。30kDa的浓缩柱浓缩纯化后的样品，最后进行SDS—1．4SDS一聚丙烯凝胶电泳PAGE凝胶电泳检